【摘 要】
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目的胶质瘤是成人最常见并且最致命的原发恶性脑肿瘤之一。尽管结合手术、放疗和化疗等综合治疗,但最具侵袭性的胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)病人的平均中位生
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目的胶质瘤是成人最常见并且最致命的原发恶性脑肿瘤之一。尽管结合手术、放疗和化疗等综合治疗,但最具侵袭性的胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)病人的平均中位生存期仍只有14.6个月。越来越多的证据表明,存在起源于胶质瘤的干细胞,正是由于它们的存在以及其多向分化和快速增殖的特性,导致胶质瘤病人的预后很差。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一群长度大于200个核苷酸的非编码转录因子,许多研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展过程中可能存在着大量复杂的功能。据报道,lncRNA-MALAT1可能对肿瘤干细胞有着多方面的影响。然而,还没有研究表明肺腺癌转移相关转录因子1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)在胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)增殖以及干性维持方面的具体作用。所以,我们通过下调MALAT1在SHG139s干细胞中的表达来研究其在调节GSCs增殖和干性维持方面的生物学功能。随后,我们进一步研究了MALAT1在胶质瘤干细胞增殖以及干性特征中的潜在分子机制。方法1.通过基因芯片技术检测胶质瘤细胞株SHG139s及SHG139中lncRNA-MALAT1的表达情况,采用实时定量PCR(qRT-PCR)进一步验证MALAT1在两组细胞中的mRNA水平;2.以慢病毒为载体,在胶质瘤细胞株SHG139s及SHG139中下调MALAT1的表达水平;3.在SHG139s干细胞株中下调MALAT1的表达水平后,采用流式细胞周期检测、直接细胞计数以及CCK-8实验来评估低表达MALAT1后对SHG139s干细胞增殖能力的影响;4.通过细胞免疫荧光、Western blotting以及qRT-PCR来检测干细胞标记物A2B5,CD133,Nestin,Sox2,Oct-4以及Nanog的表达变化;5.提取下调MALAT1后SHG139s干细胞中的蛋白,通过Western blotting实验在肿瘤相关的信号通路中筛选出下调MALAT1后受影响最明显的一条通路,即ERK/MAPK信号通路;6.采用Western blotting、细胞免疫组化以及CCK-8实验来分析下调MALAT1后对SHG139细胞的影响。结果1.lncRNA芯片数据及qRT-PCR实验结果显示:lncRNA-MALAT1在SHG139s干细胞及SHG139细胞中均高表达,并且在SHG139s中较SHG139中表达要高(P<0.01);2.流式细胞周期检测结果提示:下调MALAT1可以减少SHG139s干细胞S期的细胞百分比,然而对于G0/G1期的细胞百分比没有显著影响(P<0.01);3.CCK-8及细胞计数实验结果表明:下调MALAT1可以促进SHG139s干细胞的增殖(P<0.01);4.免疫荧光及Western blotting实验结果显示:下调MALAT1可以减少SHG139s干细胞干性相关蛋白Nestin和Sox2的表达(P<0.01),qRT-PCR实验进一步验证了下调MALAT1可以降低Nestin和Sox2的mRNA水平(P<0.01);5.Western blotting实验结果提示:在SHG139s及SHG139细胞株中,下调MALAT1对ERK/MAPK信号通路的影响最为显著,其主要是通过影响该信号通路中P-ERK的表达水平来调控该通路的活性(P<0.01);6.细胞免疫组化结果表明:下调MALAT1能增加SHG139细胞中ki-67的表达。结论lncRNA-MALAT1在SHG139s干细胞中高表达,下调MALAT1可以减少SHG139s干性相关基因的表达,并可以通过调控ERK/MAPK信号通路的活性来促进肿瘤细胞的增殖,这些结果表明,MALAT1发挥类似抑癌基因的作用。
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