益生菌在水产界以得到了广泛的应用和认可,也以逐步成为了对虾控制病害的主要手段之一。现阶段，对于益生菌开发的种类已经非常的丰富，但是益生菌的作用机制，还不是很清楚，多处于摸索阶段。溶藻弧菌产益生菌以作为水被认可和应用，本实验基于实验室已有对溶藻弧菌投喂饲料对对虾抗WSSV感染的研究结果差异为依据，不同溶藻弧菌菌株对对虾抗WSSV的作用相差很大，本研究通过两株菌株的差异比较，本研究通过分子生物学技术手段，寻找到菌株间存在的胞外、胞内蛋白、多糖之间的差异，进一步确定两株菌株的胞外蛋白中的丝氨酸蛋白酶、胞外多糖等物质存在明显的差异。通过结果显示，溶藻弧菌的胞外产物对对虾抗病作用具有重要的价值。本研究为益生菌的筛选起到了一定的指示作用，并对益生菌的发酵和益生菌中的代谢产物中有价值的物质的进一步利用提供了一定的参考价值。本实验共分为几部分：利用16S技术、16-23S技术对菌种进行鉴定，利用SDS-PAGE,质谱技术对菌体蛋白、外膜蛋白、胞外分泌蛋白及胞外多糖进行分离及种类鉴定，对差异蛋白进行人工重组诱导纯化，通过养殖侵染免疫实验，免疫作用验证蛋白的功能。内容和方法分为以下几个方面：1通过16sDNA分子基因序列分析、结合16S-23RDNA分子手段将两株溶藻弧菌鉴定到亚种。确定两株分离自凡纳滨对虾肠道的两株菌为溶藻弧菌不同株，其16-23SRNA之间存在差异对于细菌的鉴定还有很多技术手段。2利用16S-23rDNA分子手段及RFLP技术将多株溶藻弧菌鉴定进行鉴定。将分离的多株溶藻弧菌的鉴定还有很多技术手段，利用RFLP技术将16-23SrDNA不能分离的菌株得到了进一步的分离，该分子手段结合很好的将亚种进一步的得到了分离，为溶藻弧菌的菌株鉴定进行具有一定的作用。3通过SDS-PAGE、质谱分析等手段对溶藻弧菌进行蛋白的分离，找出差异蛋白，进一步通过质谱分析鉴定出蛋白条带差异带为丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶为免疫中的重要物质，具有天然的抗病毒作用，进一步推测溶藻弧菌中的胞外产物中的丝氨酸蛋白酶具有抗病毒对虾WSSV的作用，但由于其占胞外总蛋白含量较低，推测其丝氨酸蛋白酶的作用还需进一步验证。4通过SDS-PAGE、质谱分析等手段对溶藻弧菌全蛋白进行蛋白的分离，找出差异蛋白通过质谱分析鉴定出蛋白条带为铁载体蛋白，通过人工重组铁蛋白质粒技术，将FER基因克隆并表达至载体pBAD/gIIIA中，构成重组载pBAD/gIIIA-FER之质粒。将重组载体转化入大肠杆菌Top10中进行原核表达，纯化得到人工重组铁载体蛋白,在阿拉伯糖的诱导下，通过Western-blot实验结果显示,得到预期的目标蛋白，证实重组表达蛋白实验成功。5通过利用人工合成的重组细菌，在阿拉伯糖的诱导下，对于铁蛋白的功能进行验证，结果表明铁蛋白本身只是有一定的提高免疫的作用，推迟对虾的半数致死时间，最后免疫反应侵染实验结果全部死亡，进一步说明细菌铁载体本身主要是通过竞争铁离子抑制其他细菌的繁殖，而该蛋白不能完全达到溶藻弧菌整体的作用效果，也进一步说明益生菌应用的本身是通过整体的作用达到益生的效果。6通过利用细菌胞外多糖提取技术，得出两株菌株之间的胞外多糖的产出率存在较大差异，虽然只有对于乳酸杆菌胞外多糖免疫作用的研究，本实验结合前期的实验基础进一步证实溶藻弧菌代谢产物中的多糖物质应该是这两株溶藻弧菌产生对对虾抗WSSV的作用差异的关键因素，为益生菌的有益产物的开发、利用具有重要作用，为益生菌对虾抗WSSV的防治提供了理论基础。综上所述，我们可以得出以下结论益生菌本身整体性起作用，单独分离某一个成份并不能够完全取代益生菌抗WSSV感染的作用，本实验有助于进一步推动益生菌在水产养殖中的应用具有一定的价值。