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3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)-呋喃酮( 3-chloro-4- ( dichloromethyl )-5-hydroxy-2[5H] -furanone,MX),属氯化呋喃酮类物质,主要产生于造纸业氯化漂白和饮用水氯化消毒过程,是饮水氯化消毒副产物中的新成员。国际癌症研究署(IARC)已将其列为人类可能致癌物。MX在饮用水中的浓度仅为纳克级,但其强而广泛的遗传毒性作用、对动物多脏器的致癌作用、加上近年来不断升高的检出水平,引起国际上的高度关注。世界上众多实验室已在鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)中证实了MX极强的诱变活性;体内外哺乳动物细胞试验也显示其广泛的遗传毒性,如引起遗传物质发生碱基突变、DNA损伤、染色体畸变(CAs)、姊妹染色体交换(SCEs)等;整体动物试验发现MX可导致实验大鼠多脏器肿瘤。然而MX对人类来源细胞遗传毒性作用的研究甚少,其致癌机制也是不明确的。本实验室以体外培养的正常人类来源胚胎肝细胞(L-02细胞)为靶细胞,通过原位杂交试验发现MX可诱导L-02细胞ras-mRNA的表达,推断ras基因可能参与MX的致癌过程。为进一步阐明ras基因涉及的MX致人类细胞恶性转化机制,本研究采用PCR-克隆测序及免疫细胞化学的方法进行MX作用后L-02细胞中ras基因突变、ras蛋白表达水平的检测。此外,氧化应激在肿瘤的发生中起着重要作用,是化学诱变剂产生遗传毒性机制之一;而肿瘤的发生是多机制交织的复杂过程。MX的致癌过程是否涉及氧化应激,MX能否引发L-02细胞氧化损伤?本研究又着眼氧化应激的三个生物学标志物—脂质过氧化损伤标志物丙二醛(malondialdehyde,MDA)、抗氧化分子还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG),运用化学比色、高效液相色谱-电化学-紫外(high performance liquid chromatography-electrochemistry-ultraviolet,HPLC-EC-UV)检测技术研究MX对L-02细胞氧化应激水平的影响,以期从另一个侧面探讨MX的致癌机制。本文由三部分组成:第一部分:MX诱导人胚胎肝细胞ras基因突变的研究设MX染毒剂量为300μmol/L,二甲基亚砜(DMSO,10ml/L)做溶剂对照,将L-02细胞连续染毒培养12天,收获细胞提取基因组DNA,应用PCR-克隆测序法检测ras基因(K-ras、H-ras、N-ras)12、13、61密码子及其周围碱基是否存在突变。结果发现:MX染毒组L-02细胞存在H-ras基因57密码子由GAT到GGT的置换,未检测到该组细胞K-ras、N-ras及H-ras12、13、61密码子的突变;DMSO溶剂对照组相应的ras基因目的片段均未检测到突变。试验结果表明MX可能诱导L-02细胞ras基因突变,ras基因突变可能参与MX致人类癌症过程。第二部分:MX诱导人胚胎肝细胞ras蛋白表达的研究MX染毒浓度设10、30、100、300μmol/L 4个剂量,二甲基亚砜(DMSO,10ml/L)为溶剂对照,将L-02细胞染毒24小时后,采用免疫细胞化学技术检测细胞内P21ras蛋白的表达水平。结果显示:最高剂量组(MX300μmol/L)可见胞浆呈现明显棕黄色的阳性细胞,该组细胞胞浆的平均光度与溶剂对照组相比,差异具有显著性意义(P<0.001);而其余各剂量组细胞胞浆的平均光度与溶剂对照组相比均无显著增高。由此认为MX可诱导L-02细胞P21ras蛋白表达增强,但存在剂量阈值。第三部分:MX诱导人胚胎肝细胞氧化应激的研究MX染毒浓度设10、30、100、300μmol/L 4个剂量,二甲基亚砜(DMSO,10ml/L)为溶剂对照,将L-02细胞染毒24小时后,检测L-02细胞内脂质过氧化产物MDA、抗氧化分子GSH和DNA氧化损伤标志物8-OHdG的含量。结果发现:与溶剂对照相比,30、100、300μmol/L的MX能明显增加L-02细胞中脂质过氧化产物MDA的含量(P<0.05,P<0.001,P<0.001),100、300μmol/L的MX使L-02细胞中抗氧化分子GSH水平显著性降低(P<0.001,P<0.001)、DNA氧化损伤标志物8-OHdG生成量显著性增加(P<0.05,P<0.05)。在MX0～300μmol/L浓度范围内,L-02细胞的MDA含量与8-OHdG生成量呈正相关(r=0.767,P<0.01);GSH水平与8-OHdG生成量呈负相关(r=0.761,P<0.01)。实验结果表明MX可诱导L-02细胞氧化应激,使其脂质过氧化反应增强、抗氧化作用降低、DNA氧化损伤增加;MX引发的脂质过氧化反应和抗氧化力下降可能是DNA氧化损伤的影响因素。MX经由氧化应激对生物大分子的损伤可能是其致癌机制之一。