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天然橡胶(Hevea brasiliensis Musll-Arg)作为世界重要的战略性物资之一,具有重要的经济意义。炭疽病是橡胶树上一种重要的叶部病害,其病原菌主要有胶孢炭疽菌复合群和尖孢炭疽菌复合群,其中胶孢炭疽菌复合群中又以Colletotrichum siamense为主要致病菌。附着胞是病原真菌侵入寄主形成的侵入结构,附着胞是否能正常成熟,附着胞膨压是否能达到足以穿透寄主表皮,这些过程都与病原菌是否具有致病力直接相关。本课题组前期克隆获得橡胶树炭疽病菌的脂滴包被蛋白编码基因CgCap20,该基因缺失突变体与野生型相比菌体内脂滴数量降低、附着胞膨压降低、致病力降低,表明CgCap20基因对病原菌的附着胞膨压和致病力有一定的作用,目前对于丝状真菌脂滴包被蛋白的调控作用机制未见报道。已知哺乳动物和昆虫中的脂滴包被蛋白受到蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)的调控。为求证丝状真菌中是否也存在PKA调控脂滴包被蛋白的类似调控途径,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌C.siamense HN08菌株的PKA催化亚基PKAC1、PKAC2,使用实时荧光定量PCR技术,在转录水平了解PKA亚基基因与CgCap20基因在表达量存在一定正相关关系;通过GST Pull-down技术和酵母双杂交技术,明确了 PKA两催化亚基与CgCap20的互作关系。本研究主要研究结果如下:1、采用多基因序列分析法,利用保守引物克隆了供试菌株HN08的ITS(Internal transcribed spacer)、CHS-1(Chitin synthase)、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、ACT(Actin)、ApMAT(partial mating type(Mat1-2)gene)和 GS(glutamine synthetase)六个基因,序列登录号分别为 KT924457、KT924475、KT924488、KT924504、MF036144、MF036157。将六基因拼接序列进行聚类分析,可将菌株HN08鉴定为 Colletotrichum siamense。2、从GenBank中搜索已知的炭疽菌及其他真菌PKA催化亚基基因序列,比对分析设计引物对,采用PCR和qRT-PCR的方法获得炭疽菌C.siamense的PKA两个催化亚基PKAC1与PKAC2全长编码序列,序列分析结果显示:催化亚基PKAC1编码498个氨基酸,包含3个内含子;PK4C2基因编码381个氨基酸,包含2个内含子;两基因均含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和S_TK_X;聚类分析显示两基因与胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)依赖cAMP蛋白激酶催化亚基序列有高度同源性。3、通过实时荧光定量PCR法分析经PKA激活剂Forskolin(浓度为30μmoL/L)、抑制剂IBMX(浓度为30μmoL/L)处理和未经处理的HN08菌株和GFP标记转化子中的催化亚基基因PKAC1和PKAC2、调节亚基基因PKAR、以及CgCap20基因表达关系,结果显示,经激活剂处理后菌株中的PKA三亚基基因与CgCap20基因的表达量比对照组均呈现上调趋势。相反,经抑制剂处理后PKA三亚基基因与CgCap20基因的表达量均降低。当PKA亚基基因表达量升高时,CgCap20基因的表达量也增长,反之亦然。初步证实(CgCap20基因的表达量受到PKA亚基基因的表达量的正向影响。4、利用酵母双杂交系统对PKAC1、PKAC2与蛋白CgCap20进行胞内的互作验证,结果显示CgCap20蛋白与PKA催化亚基PKAC1、PKAC2亚基间,均发生相互作用的关系。5、构建PKAC1、PKAC2和CgCap20的原核表达载体,经诱导表达条件优化选择后,发现诱导剂IPTG浓度为1mmol/L时,于28℃连续诱导6h后,PKAC1与PKAC2在上清中能够大量表达;当诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L时,于16℃连续诱导20h后,CgCap20在上清中能大量表达。将重组蛋白纯化后,采用GST Pull-Down方法体外证实了 PKAC1与CgCap20间存在互作关系,但PKAC2与CgCap20的互作关系与酵母双杂结果不一致,还需要进一步确认。