论文部分内容阅读
目的:天疱疮是一种以皮肤、黏膜为靶器官的危重的自身免疫性大疱性皮肤病,通常认为外周血循环中的特异性抗桥粒芯糖蛋白1(Desmoglein1,Dsg1)和(或)桥粒芯糖蛋白3(Desmoglein3,Dsg3)抗体通过破坏角质形成细胞间的桥粒结构,导致局部棘层松解的发生,进一步形成表皮内水疱。大多学者认为导致天疱疮疾病发生的特异性自身抗体来源于外周血循环中的B细胞,而皮肤仅仅是疾病的靶器官,因此目前对于天疱疮免疫机制的研究多集中于外周血淋巴细胞,为明确天疱疮患者皮损局部的免疫机制,本课题对寻常型天疱疮患者皮损局部淋巴细胞的表型及功能进行了研究。方法:流式细胞术检测天疱疮患者皮损局部B细胞、Dsg特异性B细胞、皮损及外周血滤泡辅助性T细胞的表达,并与正常对照进行比较;固相酶联免疫斑点技术(Enzyme-linked Immunospot Assay,ELISPOT)测定天疱疮患者皮损局部Dsg特异性抗体分泌细胞(Antibody Secreting Cell,ASC)的比例;酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA法)检测皮损淋巴细胞培养上清中抗桥粒芯糖蛋白1(Desmoglein1,Dsg1)与抗桥粒芯糖蛋白3(Desmoglein3,Dsg3)特异性抗体滴度,以及患者血清中抗Dsg1与抗Dsg3抗体滴度;应用免疫印迹技术(Western blot)确定皮损淋巴细胞培养上清中的抗体是否与角质形成细胞提取物中分子量为130kDa及160kDa的抗原结合;相关数据采用GraphPad Prism version 5.0软件进行分析,所有数据以x~-±SEM表示,用非参数检验(Mann-Whitney U test)或未配对T检验(Unpaired T test)比较两组间差异;采用Pearson相关系数或Spearman等级相关分析患者皮损淋巴细胞培养上清中抗Dsg1、抗Dsg3抗体与天疱疮疾病面积指数(Pemphigus Disease Area Index,PDAI)的相关性以及外周血滤泡辅助性T细胞比例与患者血清抗Dsg1、抗Dsg3特异性抗体滴度的相关性,采用受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线统计分析,选取天疱疮患者皮损淋巴细胞培养上清抗Dsg抗体滴度值所对应约登指数最大的值为抗体滴度临界值。结果:寻常型天疱疮患者皮损局部CD19~+B细胞比例为(4.27±1.13)%,与正常对照(0.61±0.31)%差异显著(P=0.0002),并且CD19~+B细胞表面特异性表达Dsg1与Dsg3,比例分别为(12.87±1.267)%与(10.42±1.243)%;ELISPOT结果显示患者皮损局部Dsg1与Dsg3特异性ASC的比例分别为(0.22±0.031)%与(0.54±0.095)%;局部淋巴细胞体外培养6天的上清中可检测到抗Dsg1和Dsg3特异性抗体,抗体滴度分别大于0.64和0.92即为阳性,阳性率分别为85%和95%;免疫印迹技术证实培养上清中的抗体可与角质形成细胞抗原中分子量为130kDa的抗原结合;天疱疮患者皮损局部CD3~+T细胞与CD3~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞的比例分别为(71.18±3.95)%与(2.12±0.32)%,Tfh细胞表达与正常对照差异不明显(P=0.5861);天疱疮患者皮损局部T细胞在经过PMA/Ionomycin刺激后,分泌IL-21明显增加(3.98±0.87)%,与正常对照(1.21±0.06)%差异显著(P=0.0195),并且有(47.87±7.803)%分泌IL-21的CD4~+T细胞也分泌IL-17A,其分泌IL-17A的比例较CD4~+IL-21~-细胞明显增加(P=0.0294);各疾病期天疱疮患者外周血Tfh细胞及CD45RA-活化的Tfh细胞的比例均显著高于正常对照(P<0.0001);初发的天疱疮患者应用糖皮质激素治疗,皮疹达到稳定后,其外周血Tfh细胞的比例(0.16±0.11)%与活化Tfh细胞比例(0.11±0.09)%均较前下降(P=0.0096,P=0.0019),后者更为显著;天疱疮患者外周血Tfh细胞比例与血清抗Dsg1及Dsg3抗体滴度均呈正相关(R=0.631,P=0.017与R=0.285,P=0.004)。结论:寻常型天疱疮患者皮损局部有Dsg特异性B淋巴细胞及抗体分泌细胞浸润,细胞体外培养后可产生特异性抗Dsg1与Dsg3抗体,Th17细胞在皮损局部分泌IL-21,辅助B细胞活化成熟并分泌特异性致病性抗体,在皮损形成及疾病的加重过程中发挥重要作用。