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氰戊菊酯(fenvalerate,Fen)是一种重要的环境化学污染物(ECPs),因其广谱高效且在环境中可相对快速降解等优点而被广泛使用。但已有研究显示氰戊菊酯暴露可导致雄性生殖功能的损害。自然界大多数生物的生理和行为功能都存在昼夜节律。正是由于这种节律的存在,使得机体在昼夜24小时中不同时相对同一药物或毒物的敏感性不同。动物实验表明,对相同剂量农药的毒性反应,有时在其他条件一致的情况下,仅仅由于染毒时间的不同就会造成中毒程度的差别,甚至出现在一个时间高度敏感,而在另一个时间完全不发生反应的“全或无”现象。本研究从生物钟基因调节生物节律的角度,将时间生物学与生殖毒理学方法相结合,研究农药氰戊菊酯对男(雄)性生殖功能的时间毒性及其机制,为农药暴露致男性生殖功能障碍的诊治和预防提供新的途径。第一部分氰戊菊酯对雄性大鼠生殖功能的昼夜时间毒性近年来有关氰戊菊酯暴露对生殖系统的危害越来越引起国内外学者的关注。研究表明氰戊菊酯可干扰机体的生殖内分泌功能,能够与雌激素受体结合而产生拟雌激素活性,在报告基因实验中也被证实具有拟雌激素和抗雄激素活性。氰戊菊酯暴露能引起精液质量下降,影响睾酮合成,对男(雄)性生殖系统可产生损害作用。目的:研究氰戊菊酯对雄性大鼠生殖功能的昼夜时间毒性,为合理使用氰戊菊酯提供理论依据。方法:在一天中不同的昼夜时间点(CT9:00、CT13:00、CT17:00、CT21:00、CT1:00、CT5:00)对雄性大鼠进行氰戊菊酯染毒,染毒浓度60mg/kg,染毒30天后,在各时间点(CT9:00、CT13:00、CT17:00、CT21:00、CT1:00、CT5:00)对大鼠进行眼眶静脉取血,检测血清睾酮(T)、雌激素(E2)、促性腺激素释放激素(Gn RH)、促黄体生成素(LH)、卵泡生成激素(FSH)的水平,研究氰戊菊酯对雄性大鼠生殖功能的昼夜时间毒性。结果:氰戊菊酯暴露后,大鼠血清睾酮水平较对照组均显著下降,而雌激素、促性腺激素释放激素、促黄体生成素和卵泡生成激素水平升高。对照组大鼠睾酮及雌激素的分泌具有昼夜节律,睾酮峰值位相分别为:-136.57(CT1:00)、-170.06(CT5:00)、-34.92(CT9:00)、-85.08(CT13:00)、-89.13(CT17:00)和-120.29(CT21:00);雌激素峰值位相分别为:-45.8(CT1:00)、-43.61(CT5:00)、-100.55(CT9:00)、-51.99(CT13:00)、-56.45(CT17:00)和-45.64(CT21:00)。氰戊菊酯染毒后,各时点睾酮水平分别下降了5.7%(CT1:00)、10.4%(CT5:00)、16.7%(CT9:00)、13.1%(CT13:00)、20.6%(CT17:00)、10.4%(CT21:00);各时点雌激素水平分别上升了2.7%(CT1:00)、23.0%(CT5:00)、40.7%(CT9:00)、26.8%(CT13:00)、52.2%(CT17:00)、33.9%(CT21:00)。睾酮和雌激素昼夜节律发生了改变,各时点睾酮峰值位相分别为:-127.78(CT1:00)、-155.42(CT5:00)、-191.9(CT9:00)、-183.06(CT13:00)、-170.78(CT17:00)和-147.97(CT21:00);雌激素峰值位相分别为:-45.8(CT1:00)、-43.61(CT5:00)、-100.55(CT9:00)、-51.99(CT13:00)、-56.45(CT17:00)和-45.64(CT21:00)。其中,改变最大的峰值位相出现在CT9时间点,此时点睾酮峰值位相推后10小时27分,雌激素峰值位相提前2小时29分。提示CT9:00是一天中氰戊菊酯暴露的敏感时间点。第二部分氰戊菊酯对雄性生殖功能昼夜时间毒性的机制探讨哺乳动物昼夜节律由生物钟基因及其蛋白产物组成的转录-翻译负反馈环来调节。哺乳动物钟基因包括Per1/2/3,Cry1/2,Clock,Bmal1等。钟基因在哺乳动物的生殖系统中相继被发现。已有研究证实哺乳动物生物节律及钟基因与生殖功能存在关联。Bmal1敲除的雄性小鼠精子畸形率增高,睾酮分泌减少。干扰雄性小鼠睾丸Clock的表达使精子顶体酶活性显著下降。提示生物钟基因对雄性生殖功能具有调节作用。另有研究表明,micro RNAs可通过转录后调控机制对其靶蛋白的表达进行调节,并参与昼夜节律的调控。目的:从micro RNAs调控生物钟基因的角度,探讨氰戊菊酯对雄性生殖功能昼夜时间毒性的分子机制。方法:选取两个时间点(CT9:00和CT21:00)氰戊菊酯染毒的大鼠,检测睾丸样本钟基因Bmal1和睾酮合成关键酶(St AR、HSD3b1、17β-HSD)的表达水平。采用micro RNA芯片筛选差异表达的micro RNA,荧光定量PCR进行结果验证。结果:氰戊菊酯CT9:00暴露组大鼠睾丸钟基因Bmal1、睾酮合成关键酶St AR和HSD3b1的表达较对照组均显著下降,CT21:00暴露组则无显著差别。CT9:00与CT21:00暴露组相比,大鼠睾丸组织中差异表达的micro RNA数量更多,差异更加明显。PCR结果验证CT9:00暴露组的mi R494-3p、mi R142-3p和mi R93-5p的表达较对照组显著升高,而CT21:00组则无明显差异。研究证实mi R-93通过转录前调控参与昼夜节律的表达,mi R-494-3p和mi R142-3p的靶基因是钟基因Bmal1。结果提示氰戊菊酯可能通过影响micro RNA对钟基因Bmal1表达的调节,改变睾酮代谢通路上关键酶的水平,从而表现出对睾酮合成的昼夜时间毒性。第三部分氰戊菊酯暴露与Clock基因多态性对男性不育的影响Clock基因位于染色体4q12的长臂上。CLOCK蛋白与BMAL1蛋白形成杂二聚体,参与多种钟基因及钟控基因的转录调控。有研究表明Clock基因也参与生殖功能的调节,在Clock基因敲除的小鼠中,由于体内激素浓度的改变而导致不育。但是在人类的生殖领域,目前还未见相关的报道。男性不育作为一个复杂疾病,是环境危险因素和遗传因素共同作用的结果。氰戊菊酯作为一种新型的II型拟除虫菊酯类农药,对暴露人群可产生多种健康危害,特别是男性生殖系统的损害。目的:研究氰戊菊酯暴露与Clock基因多态性对原发性男性不育的影响。方法:本部分以478例确诊的男性不育病例为对象,分析生物钟基因Clock三个标签SNPs(rs1801260,rs3817444和rs3749474)与精液质量的关系。以194例正常生育男性为对照,比较SNPs对血清睾酮等激素水平的影响。选取氰戊菊酯的代谢产物3-苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid,3-PBA)为内暴露标志物,应用GMDR模型,探讨氰戊菊酯暴露与生物钟Clock基因遗传多态性交互作用对原发性男性不育易感性的影响。结果:男性不育病例中,Clock基因SNP位点rs3749474与一次射精精子总数、精液体积与精子活力均存在显著相关,位点rs1801260和rs3817444分别与精子活动力和精液体积显著相关。风险分析结果显示,Clock基因的多态性位点可以影响原发性男性不育的发病风险。病例组人群尿液中3-PBA浓度为1.41 ng/ml,显著高于对照组人群的0.75 ng/ml。应用GMDR3阶交互作用模型,发现原发性男性不育病例中Clock基因SNP位点(rs3817444、rs1801260)与氰戊菊酯暴露之间存在交互作用,可以作为氰戊菊酯暴露人群发生生殖功能障碍的危险因素。结论:氰戊菊酯对雄性大鼠的生殖功能具有昼夜时间毒性,以CT9:00暴露组对大鼠生殖功能的损伤最为明显。氰戊菊酯对大鼠生殖时间毒性的产生,可能与影响micro RNA—Bmal1—睾酮代谢关键酶—睾酮合成通路的昼夜节律有关。氰戊菊酯暴露人群中,Clock基因遗传多态性可增加男性不育风险,并与原发性男性不育之间存在交互作用,是氰戊菊酯暴露人群发生生殖功能障碍的一个危险因素。