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研究背景与目的足细胞(podocyte)作为一种终末高度分化细胞，是维持肾小球滤过屏障(glomerularfiltration barrier，GFB)的最关键部分，对防止血浆白蛋白和大分子蛋白的滤过起重要作用。足细胞的损伤和丢失是导致肾脏疾病发展和肾功能衰竭的主要因素。自噬(autophagy)是存在于酵母至人类等真核生物细胞中的一种高度保守的、维持细胞自身内环境稳定的重要胞内降解机制，通过溶酶体蛋白降解途径清除受损的细胞器和细胞内毒性物质，以“垃圾处理厂”及“废品回收站”的方式为蛋白质的合成和细胞器的更新提供原料，从而维持细胞内环境的稳态及细胞的完整性。作为一种终末高度分化细胞，足细胞的存活主要依赖于自噬吞噬体有效的清除不需要和损伤的蛋白质和细胞器，以维持内环境稳定及细胞正常生命活动，但过度的自噬会导致细胞发生“自噬性程序性死亡”。定位在前自噬体和自噬体膜表面的微管相关蛋白1轻链3(microtubule-Associated Protein1Light Chain3，LC3)参与了自噬体的形成，是目前检测自噬水平的特异性标记物。LC3以LC3-I和LC3-II两种形式存在于细胞中，发生自噬时以细胞溶质形式存在的LC3-I经包含Atg7和Atg3在内的泛素样修饰加工后，与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)结合，LC3-I即转化为分子量较小的LC3-II并结合在自噬体膜上。Beclin-1是一种与自噬相关的抑癌基因，与酵母自噬基因Atg6同源，通过与III型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinaseclass III，PI3KC3)结合形成PI3K复合物，从而调节自噬体的形成。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，RAS)在肾脏疾病的病理生理进程中起重要作用，血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)作为RAS系统的主要效应分子，可通过与细胞上的血管紧张素受体(angiotensin receptor, ATR)作用，引起细胞结构和功能的损伤，近年来发现其在肾脏的局部浓度比系统水平高出60～100倍,，说明AngII对肾脏细胞的直接生物学效应可能更为关键。Rho激酶又称为Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associated kinase，ROCKs)，是Rho家族小G蛋白成员RhoA下游最主要、最具特征性的信号分子，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。多种炎症介质和细胞因子能激活Rho激酶信号通路，如转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，PDGE)、白介素1(interleukin-1，IL-1)、内皮素1(endothelin-1，ET-1)等。研究证实Rho激酶信号途径也可以通过AngII激活，但其具体机制仍然不清。Rho激酶途径具有调节细胞收缩、迁移、增生、凋亡等功能,在多种肾脏疾病的发病机制中起重要作用。法舒地尔(fasudil)作为Rho激酶抑制剂，在肾脏损伤中的保护作用被广泛的证实，如能阻止TGF-β1诱导小管上皮细胞分化成成纤维细胞，防止小管间质发生纤维化；通过抑制Rho激酶信号途径，降低炎症因子和细胞因子的分泌，减轻氧化应激和蛋白尿，及改善肾脏血流动力学来延缓糖尿病肾病的进展等。目前研究发现，Rho激酶通路在调节自噬中起重要作用，Aditi等研究发现激活Rho激酶通路，使Beclin-1BH3结构域发生磷酸化，导致Beclin-1-Bcl-2多聚蛋白复合体解离，而不影响UVRAG-Beclin-1复合体的相互作用和增加Beclin-1和Vps34的相互作用，从而引起自噬发生；Yunbo chen等研究发现Aβ活化物能上调ROCK表达而激活自噬。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的特殊抑制剂，通过抑制Beclin-1-PI3KC3复合物的形成，而抑制自噬活性。目前研究显示Rho激酶途径活化与PI3K/AKT通路的活化相关。结合ROCKs抑制剂法舒地尔对慢性肾脏病的保护作用。本研究拟采用AngII体外刺激足细胞，观察足细胞的自噬情况，并通过法舒地尔和3-MA干预此过程，初步探讨Ang II诱导足细胞自噬的可能机制，为肾脏疾病的治疗的提供新思路。实验方法1.人永生化足细胞(AB8/13)的复苏及培养，在33℃、5%CO2中增值，在37℃、5%CO2中分化成熟后实验。2.体外采用不同浓度AngII(10-8~10-6mol/l)刺激足细胞24h及固定浓度刺激足细胞不同时间(0h、6h、12h、24h、36h)后，Western blot检测足细胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表达情况。3.将足细胞(AB8/13)进行细胞爬片，用PI3K抑制剂3-MA (5mM)和Rho激酶抑制剂法舒地尔(10-7mol/l)预处理30min，AngII刺激足细胞24h后以免疫荧光法检测自噬标志物LC3的表达及分布情况。4.不同法舒地尔浓度(10-8~10-6mol/l)预处理足细胞30min，AngII刺激足细胞24h后，Western blot检测足细胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表达情况。结果1.不同浓度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足细胞24h后，Western blot检测LC3-II的蛋白表达，随着剂量的增加，LC3-II的蛋白表达增加，在浓度为10-7mol/l时达到峰值。2.固定浓度(10-7mol/l)AngII刺激足细胞不同时间(0h、6h、12h、24h、36h)，Westernblot检测LC3-II的蛋白表达，随着时间的延长，LC3-II的蛋白表达增加，在24h达到峰值，后呈下降趋势。3.不同浓度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足细胞24h后，Western blot检测Beclin-1的蛋白表达，随着剂量的增加，Beclin-1的蛋白表达增加，在浓度为10-7mol/l时达到峰值。4.固定浓度(10-7mol/l)AngII刺激足细胞不同时间(0h、6h、12h、24h、36h)，Westernblot检测Beclin-1的蛋白表达，随着时间的延长，Beclin-1的蛋白表达增加，在24h达到峰值，后呈下降趋势。5.3-MA抑制AngII诱导的足细胞LC3的表达，并抑制其向细胞核周围聚集。6.法舒地尔单独不影响足细胞LC3-II和Beclin-1的蛋白表达，但能降低AngII引起的LC3-II和Beclin-1的表达，并呈一定的浓度依赖，法舒地尔浓度为10-7mol/l时抑制作用最强。7.免疫荧光检测单独法舒地尔不影响LC3的表达，但能抑制AngII诱导的足细胞LC3的表达及向细胞核周围聚集。结论本实验发现AngII可以促进人足细胞发生自噬，并呈一定的浓度时间依赖，而PI3K抑制剂3-MA和Rho激酶抑制剂法舒地尔可以抑制AngII诱导的足细胞自噬，可能与AngII激活Rho激酶通路相关，通过抑制Rho激酶信号途径，可能成为治疗局部RAS系统激活导致肾损害的新靶点。