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目的:1.对两色金鸡菊黄酮类提取工艺进一步放大,验证其收率稳定性及提取物质量可靠性。2.根据中国药典指导原则,为两色金鸡菊醇提物建立质量标准。3.纯化和分离两色金鸡菊中的有效部位。4.探索两色金鸡菊中α-葡萄糖苷酶抑制成分。5.研究两色金鸡菊提取物抗凝血活性及其物质谱。方法:1.在课题组以申报的工艺的基础上,用多功能提取机组和多级闪蒸等设备逐步放大生产10批两色金鸡菊黄酮类化合物提取物。2.通过薄层鉴别、水分检查、炽灼残渣检查、总黄酮含量测定、总酚酸含量测定,一测多评法含量测定及指纹图谱多个方面建立两色金鸡菊醇提物质量标准。3.采用溶剂萃取,大孔树脂、聚酰胺柱层析等分离手段,对活性成分进行分离。获得的纯品通过高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）面积归一化法确定纯度,采用质谱法测定分子量,确定化合物。4.通过超滤质谱技术筛选两色金鸡菊中α-葡萄糖苷抑制成分。5.采用断尾法测定小鼠出血时间,玻片法测定凝血时间;Born法,检测两色金鸡菊对二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate,ADP）、胶原（Collagen,COL）诱导的健康志愿者血小板聚集抑制率;HPLC测定各提取物指纹图谱,比较各成分的含量变化,根据量效关系推断可能的抗凝血活性成分。结果:1.放大工艺收率基本稳定,得到10批两色金鸡菊提取物。2.薄层色谱鉴定出两色金鸡菊中马里苷,黄酮奥卡宁,奥卡宁3个主要成分;两色金鸡菊醇提物的水分不得超过15%;炽灼残渣不得超过16%;两色金鸡菊醇提物中绿原酸(C16H24O12)不得少于0.8%;flavanomarein(C21H22O11)不得少于4%;marein(C21H22O11)不得少于8.5%;3,5-二咖啡酰基奎宁酸(C25H24O12)不得少于0.5%;总黄酮不得低于9%;总酚酸不得低于28.0%;对10批两色金鸡菊醇提物样品的HPLC图谱进行相似度计算,各批次样品与对照图谱相似度均在0.9以上。3.两色金鸡菊醇提物（Ethanol Extract,ETE）经大孔树脂富集后有效成分达到50%,对醇提纯化物（Ethanol Extract purification,ETEP）进一步以聚酰胺填料分离得到一个黄酮类组分flavanomarein。4.两色金鸡菊ETEP、flavanomarein、marein对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.052,0.892,0.455mg/mL,超滤质谱实验显示两色金鸡菊中有6种成分与α-葡萄糖苷酶结合。5.在体实验显示两色金鸡菊ETE可显著延长小鼠出血时间和凝血时间（p<0.01）,体外实验显示两色金鸡菊ETE及ETEP均能明显抑制ADP诱导的健康志愿者血小板聚集（P<0.05）,而对COL诱导的健康志愿者血小板聚集无明显抑制作用。结论:1.两色金鸡菊提取黄酮类化合物放大工艺操作简单,成本低,提取物出膏率稳定在33%左右,可用于进一步的中试生产和研究。2.建立了两色金鸡菊醇提物质量标准,为其产业化提供保障。3.建立了两色金鸡菊纯化分离工艺使两色金鸡菊中的有效成分含量达到50%,并进一步分离了其中的活性单体flavanomarein,该单体可用于两色金鸡菊物质基础及作用机理的研究。4.两色金鸡菊中至少有6个化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用。5.两色金鸡菊可通过抑制ADP引起的血小板聚集起到抗凝血作用,结合指纹图谱各成分含量的变化推测出两色金鸡菊抗凝血的有效成分可能是被提纯的绿原酸、flavanomarein、marein、3,5-二咖啡酰基奎宁酸等成分。