论文部分内容阅读
目的:帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死和纹状体区多巴胺(dopamine,DA)水平减少为主要病理特点[1],其纹状体中的神经递质多巴胺和乙酰胆碱之间的相互拮抗作用失调,而导致的神经系统疾病。临床上以进行性加重的运动缓慢、肌强直、静止性震颤、姿势步态异常等为特征。如今,PD已成为危害老年人健康的位居第二的神经变性性疾病(neurodegenerative disease, ND) [2,3],60岁以上人群中患病率为1000/10万[4],并随年龄增长而增高,严重威胁着老年人的身体健康和生活质量,甚至造成残障[5]。传统的药物治疗包括多巴胺替代治疗、抗胆碱能制剂、单胺氧化酶抑制剂、金刚烷胺及多巴胺受体激动剂等,这些药物只能暂时减轻或缓解症状,而不能阻止PD的进程,长期应用疗效下降,还会出现开-关现象、剂末现象及运动障碍等[6]。外科治疗以苍白球和丘脑毁损术为主要方法,但手术创伤大,且使用对象局限。另外,深部电刺激(deep-brain stimulation, DBS)治疗PD虽然有较好的疗效,尤其是对丘脑底核的刺激要优于对苍白球的刺激[7,8],但是其远期效果不确切,且费用昂贵。由于PD主要是由黑质多巴胺神经元变性导致纹状体内多巴胺水平下降所致,因此在黑质-纹状体系统内移植能够分泌多巴胺的细胞,恢复多巴胺的神经环路,即成为一种针对病因的理想治疗方法。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)和骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)的发现和研究的不断深入,为细胞移植治疗提供了新的思路。近年,对应用NSCs和BMSCs移植治疗帕金森病的研究有很多,但少有将两种细胞进行比较研究的。在本研究中,我们采用同种异体来源的中脑NSCs和BMSCs在体外扩增培养后,立体定向移植到PD大鼠的纹状体,观察PD大鼠的行为学变化以及组织形态学的改变,探讨其在脑内的存活和分化及比较NSCs和BMSCs移植治疗PD大鼠模型的疗效。方法:①动物:封闭群清洁级成年雌性Sprague- Dawley(SD)大鼠和新生SD大鼠均由河北医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:成年SD大鼠麻醉后,借助脑立体定位仪注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)建立右侧PD模型,随机数字表法分为NSCs组14只、BMSCs组10只、空白对照组10只,选取右侧纹状体2个坐标点(in mm: A +0.6; R +4.0; V -5.0)、(in mm: A -0.7; R +3.0; V -5.0),前两组每个坐标点分别注入经Brd-U标记的NSCs悬液、BMSCs悬液5μL,共移植约1×106个细胞,空白对照组注射等量磷酸盐缓冲液。③实验评估:细胞移植后连续8周观察阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱导的大鼠旋转行为的变化,对脑纹状体区连续冠状石蜡切片进行免疫组织化学荧光染色鉴定,检测双标细胞Brd-U/nestin , Brd-U/GFAP , Brd-U/MAP-2 ,Brd-U/TH及黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数。结果:①PD大鼠行为学改变:与移植前比较,APO诱导2-8周NSCs组和BMSCs组PD大鼠的旋转次数均明显减少,这两组转数分别从移植前的(13.9±4.8)r/min和(10.5±3.1)r/min降到治疗后第8周的(6.2±3.2)r/min和(4.6±3.4)r/min,移植前后数据相比,差异都有统计学意义(P<0.05);空白对照组移植前旋转次数为(13.3±3.6)r/min,移植后第8周旋转次数为(11.4±2.6)r/min,移植前后数据无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较,APO诱导2-8周NSCs组和BMSCs组PD大鼠的旋转次数均明显减少(P<0.01),此两组间各时间点比较差异无显著性意义(P>0.05)。②免疫组织化学荧光染色结果:移植治疗8周后,NSCs组和BMSCs组PD大鼠脑内均有Brd-U阳性细胞的存在,以纹状体移植区居多,且Brd-U阳性细胞沿同侧胼胝体发生迁移;纹状体脑切片均可见一定数量双标的神经元、星形胶质细胞和TH阳性细胞,且BMSCs组的双标细胞相对多于NSCs组。空白对照组未发现Brd-U阳性细胞、微管相关蛋白2阳性细胞及TH阳性细胞的表达;各组损毁侧黑质TH阳性细胞数均有所减少,组间黑质TH阳性细胞残存率基本相似(P >0.05)。结论:①NSCs和BMSCs移植第2-8周均可明显改善APO诱导的PD大鼠旋转行为。②移植入脑的NSCs和BMSCs均可在PD模型鼠脑内存活至少8周,并可分化成神经元、星形胶质细胞和多巴胺能神经元,且可以沿同侧胼胝体发生迁移。③由于BMSCs较NSCs更易于从自体取材和体外扩增,可能更适合应用于临床自体移植。