温度敏感型永生化大鼠腹侧中脑γ-氨基丁酸能神经元前体细胞系的建立、鉴定及其发育机制研究

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亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)是一种由IT15基因上CAG重复序列异常扩展所致的常染色体显性遗传神经变性病。HD的病理改变主要表现为纹状体γ-氨基丁酸(GABA)能投射神经元的严重脱失,对其无特效治疗方法。目前针对病因的治疗研究大致有两种策略:替代策略和营养因子策略。本研究旨在寻找一种可在体外长期大量扩增培养、能够内源性表达并分泌各种神经营养因子且具有向GABA能神经元分化为特性的永生化细胞系,以实现对HD病的细胞替代和营养因子两种策略相结合的联合治疗研究;同时希望此细胞模型能用于探讨各种神经营养因子在GABA能神经元发育过程中的作用。主要研究结果如下: 1.大鼠中脑永生化神经前体细胞系RMN的特性鉴定 RMN细胞系是一株具有旺盛增殖能力的SV40/tsA58基因永生化的大鼠胚胎中脑来源的细胞系,其生长虽受温度调控但敏感性尚较差。永生化RMN细胞可表达高水平早期神经前体细胞标记物nestin、较丰富的早期神经元标记物β-tubulinⅢ、较低水平的星型胶质细胞标记物GFAP和少突胶质细胞标记物Galc,证明RMN细胞保持着神经前体细胞的发育学特征,是性质较为均一、具多向分化潜能的神经前体细胞。体外长期培养可使RMN细胞向神经元方向和星型胶质细胞方向自发分化,但此过程并不伴随细胞表型明显改变。永生化RMN细胞系可保持正常大鼠二倍体核型,裸鼠接种28周后无任何不良细胞增生,具应用安全性。 2.单克隆RMNE6细胞系是一株具有温控性的中脑永生化GABA能神经前体(祖)细胞系。 RMNE6细胞系是从RMN细胞经过亚克隆培养获得的中脑永生化单克隆细胞系。其性质单一,已初步具备神经元表型,增殖旺盛,增殖具有温控性;与RMN细胞相比,RMNE6细胞系可上调表达神经元标记物PSA-NCAM,β-tubulinⅢ、MAP2以及GABA能神经元特异标记物谷氨酸脱羧酶(GAD67);RMNE6细胞系已具备合成神经递质GABA的能力,并可通过经典的囊泡方式释放抑制性神经递质GABA;该细胞还可表达GABA转运体GAT1和GAT3,说明已初步具备由突触间隙重摄取GABA的潜能;由于它仍可低水平表达nestin,标示其发育尚未成熟,应属于永生化中脑GABA能神经元祖细胞系。 3.RMNE6细胞系具有内源性表达并自发分泌多种神经营养因子的能力 GABA能神经祖细胞系RMNE6具有内源性表达和分泌神经营养素NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5及胶质细胞源性神经营养因子GDNF的能力;其表达量明显高于尚处发育早期的RMN细胞;因此,永生化RMNE6细胞系应是能实现对HD进行细胞替代和神经营养联合治疗策略研究的理想供体细胞。 4.神经营养因子与中脑GABA能神经元的分化和成熟密切相关 RMNE6细胞系可表达神经营养素高亲和力受体TrkA、TrkB、TrkC以及胶质细胞源性神经营养因子受体GFRa-1,不表达Ret酪氨酸激酶受体和神经营养素家族低亲和力受体p75;TrkA、TrkB、TrkC和GFRa-1受体在GABA能神经元祖细胞系RMNE6中表达上调,提示神经营养素在其发育中主要由高亲和力受体Trk介导,GDNF可能只通过GFRa-1单一受体途径参与胚胎中脑GABA能神经元分化和成熟过程。 综上所述,本研究建立的具有神经营养功能的温度敏感型永生化中脑GABA能神经元前体(祖)细胞系RMNE6能够保持来源细胞的特性,可以为进一步研究治疗诸如亨廷顿病等神经系统疾病提供充足的细胞材料,也应该是体外研究GABA能神经元发育的良好细胞模型。
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