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芋螺肽是从热带海洋生物芋螺毒腺管内分离出的一类活性多肽,可以作用于多种离子通道、G蛋白偶联受体和神经递质转运蛋白等,表现出靶点调节活性,有很强的药物开发潜力。随着转录组测序技术的应用,大量的芋螺肽序列被发现,但后续的活性研究却较为滞后,仅有0.1%的芋螺肽活性得以研究,这已成为芋螺肽开发的重要瓶颈。本文从桶形芋螺毒腺管中分离鉴定新的毒素肽,并应用亲和色谱、光敏亲和标记等方法研究其相互作用蛋白,探究其作用机制。本文从中国南海桶形芋螺（Conus betulinus）毒腺管内分离纯化得到一个十肽。结合串联质谱测序、转录组预测分析和化学合成验证等3种研究手段,证实其属于contryphans毒素家族,序列为ZSGCOWKPWC-NH2（Z:焦谷氨酸,O:4-羟基脯氨酸,W:D-色氨酸）。这是首次在contryphans家族中发现焦谷氨酸这一翻译后修饰。依据contryphans家族命名原则,该十肽被命名为contryphan-Bt（Bt来源于桶形芋螺名中betulinus一词）。圆二色谱分析显示:contryphan-Bt二级结构中主要含有β-转角。动物活性实验表明:它可以造成乳鼠竖尾、翻滚等contryphans家族典型中毒症状。膜片钳检测表明:contryphan-Bt对大鼠海马神经元的钾离子通道有微弱的影响,对大鼠背根神经节神经元上的L-型钙离子通道没有影响。论文采用经典的亲和色谱法研究contryphan-Bt的作用靶点和相互作用蛋白。合成了contryphan-Bt及其衍生物contryphan-Bt-1和Bt-2,通过肽链N端、Lys7或C端偶联到NH2磁珠、COOH磁珠、NHS磁珠、CNBr活化的Sepharose 4B和PEG树脂等载体,利用载体-多肽复合物从小鼠脑组织膜蛋白、小鼠脑组织总蛋白和猪肝脏组织总蛋白中进行亲和纯化,但未发现contryphan-Bt结合蛋白。在此基础上,使用PolyHis pull-down法研究contryphan-Bt相互作用蛋白,设计合成了含6×His标签和contryphan-Bt的融合肽Bt-Acp-[His]6（Acp:6-氨基己酸）,利用该融合肽从兔脑组织膜蛋白、兔脑组织总蛋白和猪肝脏组织总蛋白中进行pull-down,纯化出一个大小约为40 kDa的结合蛋白。结合LC-MS/MS鉴定和Western blot分析,证实该蛋白为谷氨酰胺合成酶。采用微量热泳动法验证、分析了contryphan-Bt与谷氨酰胺合成酶的结合,其解离常数Kd为79.23±9.21μM,属于弱结合。基于γ-谷氨酰羟胺法的酶活性测试表明:该结合不能影响谷氨酰胺合成酶的活性,说明结合位点远离酶活中心。最后,利用光敏亲和标记技术重点研究contryphan-Bt的细胞膜作用靶点。通过在肽链中引入光敏性Bpa（p-benzoyl-L-phenylalanine）、空间臂6-氨基己酸和亲和纯化标签biotin,合成了光敏探针biotin-Acp-Bpa-Bt。HPLC分析和免疫荧光实验表明该探针可以特异地结合到小鼠海马神经元细胞系HT22细胞表面。探针与HT22细胞孵育后进行紫外交联,用链霉亲和树脂回收标记蛋白或直接胶上酶切,并进行LC-MS/MS蛋白鉴定。结合已知芋螺肽的作用靶点特征,从胶上酶切鉴定得到的实验组差异蛋白中进一步筛选后,认为电压门控阴离子通道可能是contryphan-Bt的作用靶点。