线粒体是存在于真核细胞的双层膜细胞器，主要功能是进行三羧酸循环和氧化磷酸化反应。几乎所有的喜氧生物都是以三羧酸循环-氧化磷酸化作为产生ATP的主要方式，为细胞的活动提供能量，因此线粒体被称为“细胞动力工厂”。线粒体基质中除包含三羧酸循环酶系、线粒体基因表达酶系，还包括线粒体DNA、RNA和核糖体。线粒体是高等动物细胞核外唯一含有DNA的细胞器，其中包含的人线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是可独立于核DNA之外进行复制、转录和翻译的双链闭合环状分子。线粒体DNA可编码13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白。当线粒体中三羧酸循环-氧化磷酸化通路异常时，例如三羧酸循环酶表达异常时，线粒体的能量代谢也会发生异常，进而影响细胞正常功能的实现。柠檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）和琥珀酸脱氢酶(Succinatedehydrogenase，SDH)是参与三羧酸循环-氧化磷酸化的两个酶。其中CS是参与三羧酸循环的限速酶，催化形成产物柠檬酸用于后续三羧酸循环，或者转运至胞质用于蛋白质乙酰化和脂肪酸代谢;SDH是三羧酸循环中唯一的多亚基线粒体膜结合酶，包括A、B、C、D四个亚基，其中SDHB亚基(Succinate dehydrogenasesubunit B)编码铁硫蛋白，参与构成酶活性区域，此外SDH还参与线粒体氧化磷酸化呼吸链电子传递。CS和SDHB均由核基因编码，参与线粒体能量代谢。目前，CS在恶性肿瘤中的表达和具体功能有不同的观点，研究报道胰腺癌和肾嗜酸细胞瘤中CS表达增加，而在多株宫颈癌细胞株中CS表达降低;SDH亚基突变能够引起多种肿瘤，SDH可能是一种肿瘤抑制基因。以上研究提示三羧酸循环酶在肿瘤发生中有重要作用。正常状态下，线粒体消耗的部分氧气会转化为超氧化物阴离子、过氧化氢和其他过氧化簇(reactive oxygen species，ROS)。与核DNA相比，由于线粒体DNA中无内含子和保护性组蛋白，使得mtDNA容易受ROS攻击，从而使DNA突变或者拷贝数发生变化。MtDNA的这种改变会影响线粒体基因的表达和一系列线粒体的功能。因此mtDNA的异常改变进而会影响线粒体氧化磷酸化反应，甚至导致恶性生长状态。相反的，当机体三羧酸循环-氧化磷酸化异常时，机体会启动代偿机制和应急方式维持能量需求，线粒体DNA拷贝数的增加可能是一种代偿机制来应对线粒体呼吸功能异常。文献报道非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞中线粒体DNA的增加与肿瘤微小残留病/持续疾病状态(MRD/PD)相关，NHL化疗后存活的残余细胞中还检测到ATP相关酶CS的上调和SDH的下调，提示CS和SDH与mtDNA的拷贝数有一定关系。卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤，由于临床发现多是晚期而使死亡率较高。目前卵巢癌治疗的瓶颈仍是转移和耐药，寻找卵巢癌转移和耐药新机制以及探索治疗新靶点仍是重中之重。目前，仅有文献报道CS在鼠卵巢癌模型中活性增加，CS和SDHB在人卵巢临床标本的表达以及与mtDNA拷贝数的关系并未进行研究。　　基于上述基础，本课题针对CS、SDHB和mtDNA拷贝数在卵巢癌的表达进行研究，体外实验发现CS基因沉默抑制卵巢癌细胞(SKOV3，A2780)增殖、侵袭、迁移能力，增加化疗敏感性，降低mtDNA拷贝数;SDHB基因沉默促进卵巢癌细胞中上述恶性生物学行为，降低顺铂敏感性，提高mtDNA拷贝数。　　本课题分为三个部分:(1)CS对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究。(2) SDHB对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究。(3) CS和SDHB对卵巢癌细胞线粒体DNA相对拷贝数的作用研究。　　第一部分柠檬酸合成酶对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究　　研究目的:　　研究柠檬酸合成酶(CS)在卵巢肿瘤组织和卵巢细胞中的表达水平，探索其对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用和机制。　　研究方法:　　1.卵巢正常上皮细胞组织原代培养，实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法检测人卵巢肿瘤组织和卵巢细胞中柠檬酸合成酶mRNA和蛋白水平;2.设计合成干扰序列基因沉默CS，检测CS基因沉默对细胞能量水平的影响(ATP、AMPK/P38MAPK);3.检测基因沉默CS对卵巢癌细胞株增殖、侵袭和迁移的影响（CCK8实验、Transwell小室）;Western blot检测增殖相关信号蛋白p-ERK、凋亡相关蛋白（Bcl-2，cleaved caspase3）及细胞侵袭相关蛋白分子(p-FAK，MMP2，Vimentin)的变化;4.检测CS基因沉默对卵巢癌细胞耐药性的影响（转染组和对照组IC50值的变化、细胞凋亡水平、细胞克隆形成能力）;DNA损伤修复角度探讨CS参与卵巢癌化疗耐药的机制:Western blot检测基因沉默前后卵巢癌细胞DNA损伤和修复能力的变化(ERCC1，γ-H2AX);5.基因芯片技术检测CS基因沉默前后基因水平变化，real-time PCR验证与耐药、凋亡和自噬相关基因(CASP7，IRF7，DDX58，ISG15，ATG12）的水平变化。　　研究结果:　　1.卵巢癌组织中柠檬酸合成酶表达水平较卵巢良性肿瘤组织高，卵巢癌细胞株SKOV3和A2780中CS水平较卵巢正常上皮细胞(HOSE)高;2.CS基因沉默前后细胞中ATP变化不明显（P＞0.05），而AMPK/P38 MAPK显著受抑制(P＜0.05);3.CS基因沉默降低卵巢癌细胞株SKOV3和A2780细胞增殖速度（P＜0.05），促进细胞凋亡（P＜0.05），同时显著抑制细胞的侵袭和迁移能力(P＜0.05);4.基因沉默CS明显降低了卵巢癌细胞对顺铂的24小时半数抑制浓度IC50值(P＜0.05)，细胞凋亡水平增加，化疗药物顺铂处理后卵巢癌细胞的细胞克隆形成能力降低(P＜0.05);同时发现基因沉默CS后，细胞DNA损伤修复能力降低（ERCC1降低），DNA损伤增加(γ-H2AX增加);5.CS基因沉默明显增加CASP7，IRF7，DDX58，ISG15基因水平(P＜0.05)，而ATG12水平降低，但不显著(P＞0.05)。　　结论:　　CS在卵巢癌组织和卵巢癌细胞中高表达，基因沉默CS能够显著抑制卵巢癌细胞的增殖活性，显著降低卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力，也可以增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。CS通过影响ERK信号通路和细胞凋亡影响卵巢癌细胞的增殖活性，通过影响MMP2，p-FAK和Vimentin蛋白分子影响卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。CS沉默通过降低癌细胞DNA损伤修复能力、增加DNA损伤提高卵巢癌细胞的化疗敏感性。　　第二部分琥珀酸脱氢酶B亚基对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究　　研究目的:　　研究琥珀酸脱氢酶B亚基(SDHB)在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达水平。探索SDHB对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的影响，并进一步研究其中的相关机制。　　研究方法:　　1.Real-time PCR和Westem blot检测SDHB在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达水平;2.Western blot检测不同卵巢癌细胞株中SDHB蛋白水平;3.SKOV3和A2780细胞中琥珀酸脱氢酶B亚基基因沉默，检测基因沉默对细胞能量水平的影响（ATP、AMPK/P38MAPK）;4.检测基因沉默SDHB对卵巢癌细胞株增殖、侵袭和迁移的影响（CCK8实验，Transwell小室）;Western blot检测增殖相关信号蛋白p-ERK、凋亡相关蛋白(Bcl-2，cleaved caspase3)及细胞侵袭相关蛋白分子(p-FAK，MMP2)的变化;5.观察基因沉默SDHB对卵巢癌细胞耐药性的影响（转染组和对照组IC50值的变化、细胞凋亡水平、细胞克隆形成能力）;DNA损伤修复角度探讨SDHB参与卵巢癌化疗耐药的机制:通过Western blot检测基因沉默前后卵巢癌细胞DNA损伤和修复能力的变化（ERCC1，γ-H2AX）;6.构建SDHB过表达质粒载体，转染SKOV3细胞进行功能回复实验（增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性相关实验）;7.从缺氧角度研究SDHB对卵巢癌影响的机制:检测SDHB基因沉默和过表达对缺氧诱导因子HIF-1α水平的影响;氯化钴诱导HIF-1α表达，检测SDHB与HIF-1α表达水平的关系。　　研究结果:　　1.SDHB在卵巢癌组织中表达低于正常卵巢组织(P＜0.05)，而且mRNA水平在卵巢癌转移灶低于原发灶(P＜0.05);2.不同卵巢癌细胞株中SDHB表达水平不同;3.SKOV3和A2780细胞中SDHB基因沉默降低细胞中ATP水平，AMPK/P38 MAPK上调;4.SDHB基因沉默增加细胞增殖速度，促进卵巢癌细胞侵袭和迁移能力;5.随顺铂浓度增加，卵巢癌细胞中SDHB水平逐渐升高;基因沉默SDHB明显增加卵巢癌细胞对顺铂的IC50值(P＜0.05)、减低细胞凋亡水平，增强细胞的克隆形成能力(P＜0.05);基因沉默SDHB后，细胞DNA损伤修复能力增加，DNA损伤降低;6.过表达SDHB后，SKOV3细胞恶性生物学行为（增殖、侵袭、迁移、化疗敏感性）部分逆转;7.SDHB基因沉默增加HIF-1α表达，过表达SDHB降低HIF-1α表达，随HIF-1α表达增加SDHB水平降低。.　　结论:　　SDHB在卵巢癌组织低表达，尤其转移灶中更低。基因沉默SDHB能够增加卵巢癌细胞的增殖活性，促进卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力，也可以降低卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，而SDHB过表达可逆转上述恶性生物学行为。SDHB是通过影响HIF-1α表达而影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为，通过影响DNA损伤水平影响化疗敏感性。　　第三部分柠檬酸合成酶和琥珀酸脱氢酶B亚基对卵巢癌细胞线粒体DNA相对拷贝数的作用研究　　研究目的:　　研究线粒体DNA相对拷贝数（mtND2/HBB）和线粒体转录因子A(TFAM)在卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤中的水平，探索CS和SDHB对线粒体DNA相对拷贝数的影响和相关机制。　　研究方法:　　1.Real-time PCR检测卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织中线粒体DNA相对拷贝数和线粒体转录因子A水平;2.Real-time PCR检测卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织中CS和SDHB基因水平;3.SKOV3和A2780细胞株分别基因沉默CS和SDHB，real-time PCR检测基因沉默前后mtND2/HBB和TFAM的表达水平;4.从线粒体DNA生成角度分别探索CS和SDHB对线粒体DNA相对拷贝数的影响:Western blot检测ERK/P38 MAPK水平，real-time PCR检测基因沉默前后线粒体DNA合成相关因子PGC-1α水平。　　研究结果:　　1.卵巢癌组织中线粒体DNA相对拷贝数和TFAM显著高于卵巢良性肿瘤组织（P＜0.05）;2.卵巢癌组织中CS基因水平显著高于卵巢良性肿瘤组织(P＜0.01)，而SDHB基因水平卵巢癌组织显著低于卵巢良性肿瘤组织(P＜0.05);3.CS基因沉默降低显著卵巢癌细胞SKOV3和A2780中mtND2/HBB水平(P＜0.05)，TFAM水平也降低但是不显著（P＞0.05）;SDHB基因沉默显著增加卵巢癌细胞中mtND2/HBB水平(P＜0.05)，而TFAM水平增加不显著（P＞0.05）;4.CS基因沉默后SKOV3和A2780两株细胞中ERK和P38磷酸化水平显著降低(P＜0.05)，同时PGC-1α基因水平降低但不显著(P＞0.05); SDHB基因沉默后两株细胞中ERK和P38磷酸化水平显著上调（P＜0.05），PGC-1α基因水平上调不显著(P＞0.05)。　　结论:　　卵巢癌组织中线粒体DNA相对拷贝数和TFAM水平均高于卵巢良性肿瘤组织，CS和SDHB表达水平影响卵巢癌细胞株线粒体相对拷贝数，可能是通过影响ERK/P38 MAPK通路实现的。