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目的: 本研究通过对丝瓜络(Retinervus luffae fructus,RLF)多糖的提取条件进行优化,并对丝瓜络多糖(Retinervus luffae fructus polysaccharide,RLFP)进一步分离和纯化。观察RLF P对3 T3-L1前脂肪细胞分化的影响,并探讨其作用机制。 方法: (1)采用单因素法和正交实验设计,确定RLFP的热水浸提的最佳工艺参数。 (2)多糖纯化过程中,采用活性炭脱色,比较Sevag法、三氯乙酸法(TCA法)和酶法脱蛋白方法。 (3)DEAE-cellulose柱层析法对丝瓜络多糖进一步分离纯化,通过紫外光谱和红外光谱对得到的组份进行初步理化性质的分析。 (4)MTT法观察不同浓度的丝瓜络多糖对3 T3-L1前脂肪细胞活性的影响。 (5)油红O染色法检测丝瓜络多糖对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。 (6) RT-PCR法检测丝瓜络多糖对3 T3-L1前脂肪细胞分化第8天脂肪分化转录因子C/EBPβ、PPARγ、C/EBPαmRNA的表达水平。 (7)Western blot检测丝瓜络多糖对3T3-L1前脂肪细胞分化第8天脂肪分化转录因子C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα蛋白的表达水平。 结果: (1)通过对热水浸提过程中影响多糖提取率的因素进行单因素和正交试验分析,获得最佳提取工艺条件为:以1:40的料液比,90℃条件下提取时间6 h,提取1次。 (2)在丝瓜络多糖的纯化过程中,根据比较三种纯化方法的多糖损失率和蛋白去除率,结果表明,Sevag法、TCA法和酶法的多糖损失率分别为29.3%、46.8%、18.7%,蛋白的去除率分别为78.9%、89.4%、72.8%。 (3)通过DEAE-cellulose柱层析,获得两个多糖组份,分别为丝瓜络提取物Ⅰ(RLFⅠ)和丝瓜络提取物Ⅱ(RLFⅡ),红外光谱分析RLFⅠ含β-D吡喃葡萄糖。RLFⅡ含吡喃环和呋喃环。 (4)MTT结果表明。RLFⅠ使3 T3-L1前脂肪细胞的活力下降。RLFⅡ对3 T3-L1前脂肪细胞的活力影响不明显。 (5)油红O染色显示,RLFⅠ减少脂肪细胞甘油三酯的聚集(P<0.05);RLFⅡ则无显著效应。 (6)RT-PCR结果显示,与对照组相比,RLFⅠ处理组3T3-L1前脂肪细胞C/EBPβ、PPARγ和C/EBPαmRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。 结论: (1)RLFP的热水浸提的最佳工艺是提取温度90℃,提取时间6 h,料液比1:40,提取1次。多糖脱蛋白工艺,综合考虑多糖损失率和蛋白去除率和提取成本,采用Seva g法比较理想。DEAE-cellulose柱层析法,分离得到RLFⅠ和RLFⅡ。 (2)RLFⅠ具有显著抑制3 T3-L1前脂肪细胞分化的能力,其分子机制可能与下调脂肪细胞分化转录因子C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα有关。