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背景介绍减压反射对心血管活动起重要的调节作用。心力衰竭(Heart Failure,HF)患者和HF动物模型的减压反射敏感性明显降低,扰乱自主神经平衡,导致交感神经兴奋性增加,而副交感神经活动下降,从而使发病率和死亡率均增加。研究HF降低减压反射的机制对预防HF引起的猝死有重要的临床意义。有文献报道减压反射的传入神经敏感性和兴奋性降低导致了减压反射敏感性降低,但传入神经对血压变化敏感性降低的机制目前仍不清楚。位于减压神经末梢的机械敏感性离子通道epithelial sodium channel(ENa C)感受主动脉弓处血管扩张,引起减压神经兴奋,从而传递血压变化的信息。ENa C水平受泛素连接酶Nedd4-2的负调控。以往的研究发现,升高体内醛固酮水平可降低减压神经中ENa C通道的表达,同时降低减压反射的敏感性。而HF患者和HF动物模型都表现出醛固酮水平升高,减压反射功能降低。目的本实验通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支制作HF大鼠模型,观察其醛固酮水平和减压反射敏感性的变化,检测结状神经节中ENa C、p-ERK1/2表达的变化,以及Nedd4-2与ENa C结合的变化,探讨HF降低ENa C的机制。方法1.采用结扎冠状动脉左前降支的方法,制作HF大鼠模型。模型制备6-8周后进行实验。2.健康雄性SD大鼠随机分为4组:(1)正常对照组(Ctrl,n=6)(2)假手术组(sham,n=6)(3)心衰组(HF,n=6)(4)心衰加螺内酯组(HF+SPI,n=6)。3.血压和心率的测量:麻醉后,股动脉插管技术测量血压和心率。4.动脉压力反射敏感性的测量:静脉注射硝普钠(SNP)和苯肾上腺素(PE)分别诱导升压反射和降压反射,将反射前后收缩压变化值与心动周期变化值之比(ΔSBP/ΔCC)作为升压反射敏感性(BRS-SNP)和降压反射敏感性(BRS-PE)的指标。5.测量血浆醛固酮浓度:取新鲜的大鼠动脉血,用大鼠醛固酮试剂盒测定大鼠血浆中醛固酮的浓度。6.采用HE染色、天狼猩红染色和Masson三色染色技术检测大鼠心脏的组织学变化。7.采用免疫组织化学技术检测结状神经节(nodose ganglion,NG)中ENa C-β、ENa C-γ、p-ERK1/2的表达,并使用Co-IP技术检测Nedd4-2与ENa C结合的变化。8.统计学处理:实验数据以均值±标准差(Mean±SEM)表示,使用Graph Pad Prism5.0统计软件,采用单因素方差分析或双因素方差分析和t检验,P﹤0.05为差异有统计学意义。结果1.大鼠心脏组织病理学检查表明,常规HE染色可见冠状动脉结扎后大鼠左心室前壁心肌梗死部位室壁变薄,心肌组织疏松,心肌细胞核消失以及大量炎症细胞浸润。天狼猩红和Masson三色染色进一步证实心肌梗死部位的成纤维化。2.模型制造8周后,测得大鼠体内的醛固酮浓度Ctrl组为362.4+26.01pg/ml,sham组为358.8+29.17 pg/ml,HF组为626.2+52.47 pg/ml,HF+SPI组为600.7+47.88 pg/ml。HF组和HF+SPI组醛固酮浓度明显高于Ctrl组(P<0.005)。3.模型制备成功后,大鼠的减压反射敏感性(BRS)分别为:Ctrl组为1.095+0.025 ms/mm Hg,sham组为1.065+0.008 ms/mm Hg,HF组为0.405+0.013ms/mm Hg,HF+SPI组为0.593+0.037 ms/mm Hg。HF组和HF+SPI组BRS明显低于Ctrl组和sham组(P<0.0001),而醛固酮受体阻断剂SPI可以减弱HF对BRS的影响,使之显著升高(P<0.001),但是不能使之恢复至正常水平。4.通过Western Blotting检测ENa C-β和ENa C-γ蛋白表达,计算条带灰度相对值,结果为:Ctrl组的NG中ENa C-β和ENa C-γ分别为1.207+0.217和0.6922+0.0363,sham组分别为1.329+0.165和0.7659+0.0352,两组间无显著差异(P>0.05);HF组分别为0.3309+0.121和0.2822+0.025,比Ctrl组明显减少(P<0.05);而HF+SPI组分别为0.736+0.0424和0.3848+0.008,也比Ctrl组ENa C表达减少。表明HF导致ENa C表达量降低。HF+SPI组与HF组相比ENa C蛋白表达量升高(P<0.05),说明SPI能改善HF引起的ENa C变化,但是不能使其恢复至正常。5.Co-IP检测Nedd4-2与β/γENa C间的结合,各条带灰度值结果为:以Nedd4-2抗体沉淀蛋白,β/γENa C抗体做western blot,Ctrl组分别为338.5+75.67和341.2+53.95,sham组分别为343.2+58.28和489.1+61.26,两组间无显著差异(P>0.05);HF组分别为1038+162.9和919.6+43.9,比Ctrl组明显增加(P<0.05);HF+SPI组分别为172.9+28.39和524.4+58.32,与Ctrl组无显著差异(P>0.05),但显著低于HF组(P<0.05)。以β/γENa C抗体沉淀蛋白,Nedd4-2抗体做western blot,Ctrl组分别为78.72+36.47和349.3+97.85,sham组分别为223.8+122.5和495.9+82.81,两组间无显著差异(P>0.05);HF组分别为2000+355.7和1701+354.8,比Ctrl组显著增加(P<0.05);HF+SPI组分别为182.6+73和228.4+89.52,与Ctrl组无显著差异(P>0.05),但显著低于HF组(P<0.05)。表明心衰大鼠结状神经节中的Nedd4-2与ENa C结合增多,醛固酮受体阻断剂SPI可以阻断它们的结合。6.Western Blotting检测p-ERK1/2蛋白表达,计算条带灰度相对值结果为:Ctrl组的结状神经节中p-ERK1/2蛋白表达为1.192+0.0926;sham组为1.087+0.302;HF组为5.210+0.581,比Ctrl组显著增加(P<0.005);HF+SPI组为1.021+0.365,与Ctrl组无显著差异(P>0.05),比HF组显著降低(P<0.005)。表明HF大鼠结状神经节中p-ERK1/2蛋白表达量显著升高,提示ERK1/2参与了醛固酮对ENa C的调节,醛固酮阻断剂可以阻断ERK1/2的激活。结论心衰大鼠升高醛固酮水平,通过受体途径,激活NG的ERK1/2,促进了Nedd4-2与ENa C的结合,降低ENa C,进而使得BRS减弱。