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食管癌(Esophageal cancer)是全球发病率第八位、死亡率第六位的恶性肿瘤,对人类的生命健康造成严重威胁。组织病理学上食管癌主要分为鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EA)。在我国,ESCC是主要的组织类型。手术是早期食管癌的主要治疗方法;对于无法实施根治性手术或中晚期食管癌患者,放疗则是重要治疗手段。然而临床上,放疗抵抗常常是局部治疗失败和复发转移的重要原因。因此,研究食管癌细胞发生放疗抵抗的分子机制,并筛选可作用靶点及潜在的放射增敏药物,对食管癌放疗疗效的提高非常关键。本研究中,我们采用了两种ESCC细胞系KYSE150和TE-1,通过持续放射剂量递增并分次照射的方法建立放射抵抗细胞株KYSE150R和TE-1R。使用MTT和克隆形成实验等检测放疗抵抗株和亲本株的增殖能力,证实了其放疗抗性的形成。为了明确细胞是否发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),我们比较了放疗抵抗与亲本细胞的形态变化,并使用transwell法检测了细胞的迁移和侵袭能力,免疫蛋白印迹检测了EMT相关蛋白的表达。另外,我们使用流式细胞术和成球实验检测了放疗抵抗株和亲本株肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)相关的特征。结果表明,KYSE150R和TE-1R表现出较高的放疗抵抗和对5-fluorouracil(5-FU)和顺铂的化学药物交叉耐药,而亲本细胞中存在高水平的凋亡率和DNA损伤。与亲本细胞相比,放疗抵抗细胞发生了EMT,其迁移和侵袭能力明显增高,具体表现为与上皮特征相关的蛋白和m RNA的表达水平降低,而与间质相关的蛋白和m RNA水平表达增加。流式细胞分析显示CD44和CD271的表达增加,这表明从亲本细胞系表型转变为“CSCs”亚型。因此,我们的研究表明KYSE150R和TE-1R细胞恶性程度更高,并已呈现EMT和CSCs表型。既往研究发现利胆酚(osalmid)是核糖核苷酸还原酶小亚基M2(ribonucleotide reductase small subunit M2(RRM2))的抑制剂,可以抑制细胞内DNA合成。因此,我们进一步研究了RRM2是否参与食管癌的放射抵抗,和利胆酚在食管癌放疗增敏中的具体作用及机理。通过免疫组织化学实验检测食管癌组织中RRM2的表达;通过MTT和克隆形成实验及活细胞计数检测了利胆酚对细胞增殖的影响;通过流式细胞术分析利胆酚对细胞凋亡和周期的影响;免疫荧光,蛋白免疫印迹和β-半乳糖苷酶染色用于检测细胞DNA损伤和衰老;最后使用异种移植小鼠模型研究利胆酚和放疗在体内是否具有协同的抗肿瘤作用。结果显示:RRM2在治疗抗性食管癌组织中的表达量高于敏感肿瘤,并且RRM2的高表达与患者的不良预后有关;在研究利胆酚的作用中,我们观察到利胆酚对KYSE150和KYSE150R,TE-1和TE-1R细胞均有直接的细胞毒性。机制上,我们发现利胆酚抑制了ERK1/2信号转导通路,并促进了放疗诱导的细胞增殖抑制、DNA损伤、细胞凋亡和衰老等作用。此外,在体外食管癌移植瘤模型中,利胆酚和放疗联合可显著抑制肿瘤的生长,且对小鼠的血液系统和内脏均无明显的毒副作用。综上,我们的研究结果表明RRM2的高表达与食管癌的放疗抵抗有关;利胆酚作为一个成熟的临床用药对食管癌细胞具有抗肿瘤作用,并且和放疗一起表现出协同作用效果,因此具有很好的临床应用前景。