第一部分雌性G蛋白偶联受体激酶5缺陷小鼠出现恶化的阿尔茨海默病样病理改变背景:现已知道性别在阿尔茨海默病(AD)的发病中是一不容忽视的危险因素,许多研究表明,AD的患病率女性显著高于男性;与男性相比,女性AD患者脑内呈现出更为严重的病理变化。最近研究揭示G蛋白偶联受体(GPCRs)激酶(5GRK5)缺陷引起的相关GPCRs脱敏障碍在早期AD的病理发生机制中具有重要作用,而且GRK5敲除/缺陷(GRK5KO)小鼠表现出早期AD病理特征和短时期记忆功能损害。但是这种病理变化在不同性别间有没有差异,目前不得而知。目的:研究GRK5KO小鼠出现的AD样病理变化是否存在性别差异,并探讨其分子机制。方法:用Campbell-Switzer银染和免疫荧光染色来观察老化的GRK5KO小鼠海马内肿胀轴突的病理变化;Western blotting检测海马内突触蛋白水平的变化;同时对上述改变在不同性别间进行深入比较。此外,用免疫酶联吸附试验检测黄体生成素(LH)诱导的环磷酸腺苷的聚积量。结果:雌性GRK5KO小鼠海马内呈簇状分布的肿胀轴突数目比雄性小鼠高出2.5倍;而且雌性GRK5KO小鼠海马内数个突触蛋白水平(包括突触素)比雄性小鼠显著减低。双因素方差分析显示性别和GRK5缺陷双因素之间呈显著协同效应,共同促进了雌性GRK5KO小鼠轴突缺陷和部分突触蛋白水平的降低。另外,LH活性增加据认为是引起AD性别差异现象的重要原因,但在本实验中LH受体脱敏并不受GRK5缺陷的影响。由此可见,雌性GRK5KO小鼠出现恶化的病理改变并不是由于LH受体脱敏损害造成的。结论:在促进雌性GRK5KO小鼠出现早期AD样病理改变的过程中,GRK5缺陷和性别双因素表现出协同效应,尽管目前其潜在的分子机制尚未阐明。第二部分G蛋白偶联受体激酶5缺陷对Tg2576小鼠脑内炎症反应的影响背景:最近的研究显示功能性(膜上)G蛋白偶联受体激酶5(GRK5)缺陷与早期阿尔茨海默病(AD)的病理发生机制存在联系。体外试验表明,GRK5缺陷通过损害相关G蛋白偶联受体(GPCRs)脱敏可以促进小胶质细胞的激活。但令人遗憾的是,GRK5敲除/缺陷小鼠(GRK5KO)除了有中等程度的轴突缺陷和突触退变以及轻度水平的β淀粉样肽(Aβ)水平上升外,并没有发现纤丝状Aβ沉积,也没有表现出任何小胶质细胞增生迹象。一种可能的解释是体内GRK5缺陷导致的功能缺失有可能被其他的GRK成员所代偿;另外一种原因在于缺少炎症启动因子,诸如纤丝状Aβ。目的:研究在纤丝状Aβ存在时,GRK5缺陷是否会加剧转瑞典突变淀粉样肽前体蛋白基因(TgAPPsw, Tg2576)小鼠脑内的炎症反应,并探讨其作用机制。方法:将具有C57/BL6遗传背景的GRK5KO杂合子与具有相同遗传背景的Tg2576小鼠杂交,以产生野生型(WT)、GRK5KO杂合子型、转淀粉样肽前体蛋白(APP)基因型以及转基因&敲除(Double)型4种基因型小鼠。用定性和定量免疫荧光(IF)染色方法来评价这些动物脑内小胶质和星形胶质细胞的增生反应。用IF染色和Western blotting分别检测脑内Aβ沉积量和水平的变化。结果:抗CD45、CD11b、OX42和白介素1β特异性抗体的IF染色可以特征化小胶质细胞的变化。IF染色结果定量分析显示,Tg2576小鼠被灭活一个拷贝的GRK5基因后导致海马和皮层内小胶质细胞数量和Aβ沉积量(包括负荷量与数量)同时上升了近1倍左右,并伴有星形胶质细胞的显著增生。而且激活的小胶质和星形胶质细胞大多位于或环绕于纤丝状Aβ斑块附近。但IF染色未发现WT和GRK5KO小鼠脑内有明显胶质细胞增生改变,也没有纤丝状Aβ沉积。此外,Aβ的Western blotting检测结果与IF染色相互印证。Spearman等级相关检验发现APP和Double小鼠海马和皮层内Aβ沉积量(负荷量/数量)与对应的小胶质细胞/星形胶质细胞数量均呈高度显著正相关。结论:Tg2576小鼠GRK5基因敲除50%后,确实加剧了脑内的炎症反应,但其加剧的方式不是直接对炎症调节因子加以调控,而主要是通过增强对炎症启动因子(纤丝状Aβ)的调节来发挥作用的。第三部分G蛋白偶联受体激酶5缺陷对Tg2576小鼠脑内β淀粉样肽前体蛋白加工过程的影响目的:研究体内G蛋白偶联受体(GPCRs)激酶5(GRK5)缺陷加剧转瑞典突变淀粉样肽前体蛋白(TgAPPsw, Tg2576)基因小鼠脑内纤丝状β淀粉样肽(Aβ)沉积的分子机制。方法:将具有C57/BL6遗传背景的GRK5敲除/缺陷小鼠(GRK5KO)杂合子与具有相同遗传背景的Tg2576小鼠杂交以建立APP (hAPPsw+/-/GRK5+/+)型及转基因&敲除(Double, hAPPsw+/-/GRK5 +/- )型小鼠。用Western blotting检测APP和Double型6月龄雌性小鼠脑内以及17天龄胎鼠皮层原代培养神经元胞膜上全长APP(flAPP)和可溶性APPα(sAPPα)的变化。结果:APP与Double型的6月龄小鼠脑内flAPP水平无差异,但Double小鼠sAPPα水平较APP小鼠明显减低;胎鼠皮层原代培养神经元胞膜上flAPP水平及sAPPα基础释放量的变化与6月龄小鼠类似,但经用乙酰胆碱毒蕈碱样受体(M)2特异性拮抗剂处理后,可以显著逆转Double胎鼠皮层原代培养神经元sAPPα释放量减低的现象。结论:体内GRK5缺陷引起M2受体脱敏障碍,可以通过调节APP的加工过程来加速Double小鼠脑内Aβ的生成。