第一部分单个DNA序列测定鉴定分枝杆菌菌种的应用价值研究目的重新系统评估和认识最常用于分枝杆菌菌种鉴定的同源基因/序列,包括16S核糖体DNA(16S ribosomal DNA,16S r DNA)、热休克蛋白65(hot shock protein65,hsp65)、RNA聚合酶贝塔亚基(RNA polymeraseβ,rpo B)和转录间区序列1(16S r DNA-23S r DNA internal transcribed spacer,ITS1)等鉴定分枝杆菌菌种的能力,发现不足,为合理解读单个DNA序列测定的鉴定结果、评估其临床应用价值、寻找更精准的鉴定分枝杆菌菌种策略提供理论依据。方法从Gen Bank下载174种分枝杆菌标准菌株全长16S r DNA、部分hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和全长ITS1序列,裁剪全长16S r DNA获得5’端16S r DNA序列;测定174株分枝杆菌临床分离菌株的5’端16S r DNA、部分hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和全长ITS1序列。分析不同DNA序列数据库完整性、分枝杆菌种间和种内变异性、以及确定相同DNA序列无法区分的菌种。结果(1)数据库完整性:全长16S r DNA有172个序列,5’端16S r DNA有173个序列,hsp65有172个序列,rpo BⅢ高可变区有152个序列、rpo BⅤ高可变区有128个序列,ITS1有104个序列。(2)种间变异性:全长16S r DNA、5’端16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区和rpo BⅤ高可变区菌种间最大变异分别为9.86%、9.86%、24.62%、19.61%、22.35%,ITS1序列长短不一,无法聚类获得最大变异度。全长16S r DNA、5’端16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1序列完全一致菌种对数分别为12、13、5、9、4、5。(3)种内变异性:5’端16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1的种内变异度在0-1.12%、0-4.57%、0-6.77%、0-8.80%、0-23.43%之间,均以戈登分枝杆菌表现出最大的种内变异性。此外,所有偶然分枝杆菌、胃分枝杆菌、新金色分枝杆菌和猪分枝杆菌临床分离株的ITS1序列测序均失败,因此无法评价其种内变异性。结论Gen Bank中分枝杆菌16S r DNA和hsp65序列的完整性较好,而rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1序列完整性略差。单独16S r DNA的鉴别能力逊于hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1。常用于菌种鉴定的同源基因/序列都存在序列一致无法鉴别的菌种,因此单一的分子标识不能将所有分枝杆菌准确鉴定到种水平。不同分子标识组合可以弥补单一分子标识在某些菌种的鉴别能力的不足,提示建立分子标识的组合策略有利于提高菌种的鉴定水平。第二部分多序列联合测序鉴定分枝杆菌菌种的应用价值研究目的评价16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1基因联合测序鉴定分枝杆菌菌种的应用价值。方法通过第一部分下载174种分枝杆菌标准菌株的16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1序列建立数据库,并基于Blast比对算法建立多序列联合比对网站。通过单独和联合应用16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1鉴定174株分枝杆菌临床分离株至菌种水平。比较不同分子标识单独,或是多序列联合鉴定结果与“金标准”--16S r DNA测序鉴定结果的一致性及鉴定到种水平的能力。结果(1)建立了一个既可用于单个DNA序列对比又可用于多序列联合比对的网站数据库。(2)多序列联合比对与“金标准”--16S r DNA鉴定结果一致率为99.43%(173株/174株),95%可信区间98.31%-100.55%。(3)hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1鉴定结果与16S r DNA测序鉴定结果一致率分别为81.03%(95%可信区间75.20%-86.86%)、99.43%(95%可信区间98.31%-100.55%)、94.25%(95%可信区间90.79%-97.71%)、87.93%(95%可信区间83.09%-92.77%)和99.43%(95%可信区间98.31%-100.55%),多序列联合鉴定结果与16S r DNA鉴定结果一致率的95%可信区间与hsp65、rpo BⅤ高可变区和ITS1等单一分子标识的鉴定结果与16S r DNA测序鉴定结果一致率的95%可信区间无交叉,有统计学意义;与rpo BⅢ高可变区鉴定结果与16S r DNA测序鉴定结果一致率的95%可信区间有交叉,无统计学意义。(4)所纳入的174株分枝杆菌临床分离株中,多序列、16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1测序鉴定获得的菌种数量分别为17、8、18、13、15、11,获得的复合群数量分别为2、6、2、4、3、1。结论(1)16S r DNA、hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1多序列联合测序结果与“金标准”--16S r DNA测序结果具有较高的一致性。(2)联合应用多序列进行分枝杆菌菌种鉴定与“金标准”--16S r DNA测序鉴定结果的一致性优于单个hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1,但与rpo BⅢ高可变区测序与“金标准”测序结果的一致性无差别。(3)由于临床分离株同源序列的变异、数据库不完整等原因,一些亲缘性接近的分枝杆会在单用hsp65、rpo BⅢ高可变区、rpo BⅤ高可变区和ITS1等分子标识鉴定菌种时候出现错误鉴定结果。(4)应用多序列联合比对鉴别分枝杆菌鉴定到种水平能力优于单序列比对鉴定水平。第三部分核糖体蛋白S1基因(rps A)作为一个新的分枝杆菌菌种鉴定标记物的价值研究目的评价核糖体蛋白S1基因(Ribosomal Protein S1 Gene,rps A)作为一个新的分枝杆菌菌种鉴定的标记物的分辨能力和可靠性。方法扩增一段565bp的rps A基因片段,标本包括42株分枝杆菌参考菌株、172株非结核分枝杆菌的临床分离菌株和16株结核分枝杆菌复合群的临床分离菌株。将PCR产物测定DNA序列,并通过DNASTAR软件的Meg Align包和MEGA软件中的多序列联合比对算法进行比对。通过邻位相连方法构建进化树。结果分枝杆菌参考菌株rps A基因的相似性在85.4%-100%之间。基于分析比较分枝杆菌属rps A基因序列提供的菌种变异度,慢生长和快生长分枝杆菌在进化树清楚的聚为两类,而且每种分枝杆菌均以独立分枝存在。此外,rps A基因序列可以区分开16S r DNA基因无法分开的堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、苏加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。rps A基因对分枝杆菌临床分离菌株菌种鉴定的正确率是97.3%(183/188),这包括8种分枝杆菌。结论rps A基因能够被有效地用来进行分枝杆菌菌种鉴定,作为16S r DNA序列分析的一个补充。第四部分DNA测序鉴定分枝杆菌菌种发现少见NTM的细菌学研究第一节从中国肺炎患者分离的副瘰疬分枝杆菌细菌学特征研究目的中国首例“肺炎”患者分离的副瘰疬分枝杆菌的细菌学特征的研究。方法采用DNA测序方法对中国首例“肺炎”患者分离的副瘰疬分枝杆菌进行菌种鉴定,采用一系列生化试验、药物敏感性试验、小鼠的毒力试验研究其细菌学特征。结果副瘰疬分枝杆菌的生化和分枝菌酸特征与瘰疬分枝杆菌相似。体外实验显示它对利福布汀、利福喷汀、阿奇霉素、头孢西丁和莫西沙星敏感。小鼠在感染副瘰疬分枝杆菌2周后时,肺组织表现为细支气管周围炎为特征的局部炎性反应。4、8周的时肺组织除表现细支气管周围炎外,还聚集有大量淋巴细胞,部分组织还形成了不典型的肉芽肿,但无坏死形成。感染的肺脏和脾脏菌落形成单位计数在8周时间里稳步增长。结论来自中国的副瘰疬分枝杆菌表型特征与瘰疬分枝杆菌相似,对利福布汀、利福喷汀、阿奇霉素、头孢西丁和莫西沙星敏感。能够在小鼠体内增殖并导致小鼠肺组织病理改变。第二节一株来自中国患者的chimera分枝杆菌细菌学和毒力研究目的从一名中国患者痰液分离到一株名为chimera分枝杆菌的细菌,该细菌是最近命名的NTM。对这株细菌进行了生化、分子鉴定、药物敏感性和毒力研究。方法通过一系列生化试验分析该菌株的生化特征;通过HPLC分析该菌株的分枝菌酸样式;扩增16S r DNA、ITS1、hsp65和rpo B基因,分析获得序列与其他分枝杆菌序列的相似性;检测22种抗菌药物对这株细菌的MIC值;通过静脉注射C57BL/6小鼠评价这株细菌的毒力,并以结核分枝杆菌H37Rv做对照。结果生长特征和分枝菌酸样式分析揭示这株细菌是鸟分枝杆菌复合群成员。BLAST分析扩增的序列显示这株细菌与chimera分枝杆菌相关。药物敏感性试验显示这株细菌对利福布汀、利福喷汀、克拉霉素、阿奇霉素、亚胺培南和头孢西丁敏感。这株细菌的小鼠模型展现的细菌载量和组织病理揭示这株细菌是高毒力的。结论chimera分枝杆菌必须通过DNA测序方法鉴定;来自中国的chimera分枝杆菌对利福布汀、利福喷汀、克拉霉素、阿奇霉素、亚胺培南和头孢西丁敏感;能够在小鼠体内增殖并导致其肺脏病理改变,与H37Rv毒力相同属于高毒力细菌。第五部分命名属于戈登分枝杆菌复合群的新菌种-中间戈登分枝杆菌目的命名一种新分枝杆菌,中间戈登分枝杆菌,为完善非结核分枝杆菌菌种分类提供依据。方法分析菌株24T、菌株334(副戈登分枝杆菌临床分离菌株)和戈登分枝杆菌标准菌株ATCC 14470T在生化特征、分枝菌酸和DNA序列方面的差异。结果菌株24T与戈登分枝杆菌ATCC 14470T和副戈登分枝杆菌49061T/334的生化特征仅仅在尿素酶试验和苦味酸试验有区别;菌株24T分枝菌酸样式和戈登分枝杆菌ATCC 14470T、副戈登分枝杆菌334不同;菌株24T的16S r DNA和16S r DNA-hsp65-rpo B串联序列进化树、距离矩阵分析显示属于戈登分枝杆菌复合群,hsp65和rpo B进化树、距离矩阵分析与与戈登分枝杆菌ATCC 14470T和副戈登分枝杆菌49061T/334不完全相同,特别是变异度大于3%。结论我们推荐这株菌株为一个新的分枝杆菌菌种,中间戈登分枝杆菌(Mycobacterium intergordonae),标准菌株号24T=CMCC 93559T。