桔小实蝇Bactrocera dorsalis隶属于双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一种重要的世界性害虫。该虫可为害46个科的250多种水果和蔬菜,并造成严重的经济损失。桔小实蝇具有很强的扩散性和环境适应性,能进行远距离扩散并迅速占领入侵地。该虫原产于热带和亚热带地区,现已成为中国南部、东南亚、印度次大陆和夏威夷群岛危险性果蔬害虫,这些地区的夏季高温往往高于40℃；随着全球气候变暖,桔小实蝇逐渐向高纬度地区扩散,在中国湖北、江苏等冬季温度低于0℃的地区也可完成越冬。桔小实蝇适宜发育的温度范围在15～34℃之间,因此,夏季高温和冬季低温等极端温度必将对桔小实蝇造成热胁迫。在长期的进化过程中,桔小实蝇形成了一系列反应机制来应对热胁迫。热激蛋白是细胞或生物体在受热或其他因素刺激后,所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白,与生物体的热耐受性和抗逆性有重要的关系。热胁迫带来的氧化压力使生物体内产生过氧化反应,而抗氧化系统则可以清除氧自由基,缓解氧化压力,修复胁迫损伤等。以双向电泳和质谱鉴定技术为核心的蛋白质组学的发展为分离鉴定昆虫体内的蛋白质创造了有利条件。差异蛋白质组学的兴起,更是为分离已知的热胁迫应激蛋白,以及去寻找那在抗热胁迫响应过程中起作用的未知蛋白提供了有利工具。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,在全球气候变暖的大环境下,瞄准生物适应热胁迫这一国际研究热点,利用差异蛋白质组学方法分离并鉴定了热胁迫下桔小实蝇的响应蛋白；采用微量滴定酶标板法测定了其体内抗氧化酶活性的变化；利用RT-PCR、RACE及qPCR等技术克隆并解析了桔小实蝇热激蛋白基因和抗氧化酶基因及其转录表达模式,从不同角度阐明了桔小实蝇对热胁迫的响应机制。经过近3年的研究,获得以下主要结果：1.桔小实蝇在热胁迫下的抗氧化反应丙二醛(MDA)是多元未饱和脂肪酸过氧化反应的主要氧化产物,可以通过测定其含量来明确脂质过氧化的水平(LPO),因此MDA已被作为氧化胁迫的一个生物标识。高温和低温胁迫下桔小实蝇体内的MDA含量都较对照27℃显著升高,说明热胁迫打破了桔小实蝇体内氧化还原反应的平衡,诱导了体内抗氧化酶活性增强。桔小实蝇遭受热胁迫后,其体内超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著升高,催化体内因氧化胁迫而产生的高浓度超氧阴离子(O2·-)发生歧化反应生成过氧化氢(H202)。随着温度极端升高和降低,SOD活性升高,同时随着胁迫时间延长而呈现先上升后下降的趋势。过氧化氢酶(CAT)活性较27℃显著增强,分解过量的H202,生成对机体无害的H20和02,以降低体内活性氧(ROS)的含量而缓解氧化压力：随着温度极端升高和降低,CAT活性升高,同时随着胁迫时间的延长,CAT活性也呈现上升后又下降的变化趋势。谷胱甘肽S-转移酶(GST)的活性也发生了显著的变化,高温胁迫下显著升高,低温胁迫下随着胁迫时间的延长,GST活性下降后又快速上升并高于对照27℃下的活性；GST活性升高,分解过多的脂类过氧化物,在桔小实蝇抗热胁迫导致的氧化胁迫反应中发挥了重要作用。过氧化物酶(POD)和总抗氧化能力(T-AOC)以较高的活性值稳定地发挥着抗氧化胁迫的作用。2.桔小实蝇在热胁迫下的差异蛋白质组学研究双向电泳是一种对生物体内复杂蛋白质体系进行高效分离的技术,分辨率高、重复性好和稳定性强是其最基本的特征。蛋白质样品的质量直接影响双向电泳的分离效果和生物信息的完整性。本研究选择桔小实蝇体内的总蛋白进行分析,建立了一套稳定、重复性好的双向电泳技术体系,全面挖掘桔小实蝇响应抗热胁迫反应的功能蛋白：通过在常规裂解液中引入2M硫脲提高了蛋白质特别是疏水蛋白的溶解性;继而利用蛋白质纯化试剂盒纯化获得了高质量的蛋白质样品；在胶条平衡缓冲液中增加了甘油和SDS的含量提高了平衡效果；PAGE凝胶经质谱兼容的银染方法染色,最终获得了高分辨率的双向电泳图谱。上述双向电泳技术体系的建立为分离和鉴定桔小实蝇抗热胁迫响应蛋白质奠定了坚实基础。利用蛋白质组学技术对桔小实蝇抗热胁迫的响应机制进行了研究。将试虫在40℃高温和0℃低温下胁迫3h后,提取总蛋白质,使用pH3-10、17cm的胶条和10%SDS-PAGE凝胶进行双向电泳。经PDQuest V8.0.1软件分析,三组双向电泳图谱具有较高的匹配率。使用PDQuest自动匹配功能,结合人工增加和去除蛋白点,以27℃为对照,确定了61个差异较大的蛋白质。在热胁迫中表达一致的有37个,其中上调30个,下调7个。经MALDI-TOF-TOF串联质谱测序分析,成功鉴定出40个蛋白质。这些蛋白质中含有15个与氧化还原相关的酶类蛋白,如Superoxide dismutase、Peroxiredoxin1、Cytochrome P450和Respiratory-chain NADH dehydrogenase等；有8个各类离子和代谢物质的转移酶,如Peptide-O-fucosyltransferase、Glutathione S-transferase和Guanido phosphotransferase等；还有各种激酶和线粒体糖蛋白以及热激蛋白Hsps等。3.桔小实蝇热激蛋白基因克隆、序列分析和mRNA表达模式解析利用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得了4条Hsps编码基因,其中1条Hsp90家族基因BdHsp901,2条Hsp70家族基因BD1和BD2,1条Hsp60家族基因Hsp60;并从GenBank数据库中下载其他昆虫的Hsps氨基酸序列,采用软件MEGA4.0用邻接法(Neighbor-joining method, N-J法)构建了上述4条桔小实蝇Hsps基因序列的系统发育树,确定了它们的分类关系；以桔小实蝇的actin基因(GenBank登录号L12254)为内参,采用实时荧光定量qPCR技术测定了这4个Hsps蛋白质编码基因在热胁迫下的mRNA表达模式。桔小实蝇Hsp90家族基因BdHsp901的全长cDNA序列在GenBank中的登录号为JN168997。该基因全长2621bp,开放阅读框2148bp,编码715个氨基酸。具有1个Hsp90家族签名序列(signature) YSNKEIFLRE,根据C-端基序MEEVD确定其为胞质型热激蛋白。从建立的系统发育树中发现,BdHsp901编码的氨基酸序列和地中海实蝇Ceratitis capitata的关系最近,它们最先聚为一支,然后与刺舌蝇Glossina morsitans聚为一支,而与鳞翅目的亲缘关系较远。高温胁迫3h后,BdHsp901的表达显著上调,说明桔小实蝇通过体内大量积累该基因编码的蛋白质以适应来自环境高温的胁迫压力。Hsp90家族热激蛋白是生物体内含量最高的蛋白之一,但低温胁迫只有在极端低温-5℃诱导3h后才发生了显著上调,这说明在其他的低温下体内BdHsp901正常的高含量足以保护细胞不受胁迫伤害。两个Hsp70家族热激蛋白BD1和BD2在GenBank中的登录号分别是GU591408和GU591409。BD1基因cDNA全长2086bp,开放阅读框1962bp,编码653个氨基酸,具有3个Hsp70家族签名序列IDLGTTYS. IFDLGGGTFD VSIL和IVLVGGSTRIPKVQR。BD2基因cDNA全长2258bp,开放阅读框1911bp,编码636个氨基酸,具有2个Hsp70家族签名序列IDLGTTYS和IFDLGGGTFDVSIL.两者都具有非细胞器基序RARFEEL、C-端高度保守的细胞质Hsps基序EEVD以及双组份细胞核定位信号KK和RRLRT。系统发育树结果分析表明,两个Hsp70家族基因都与双翅目实蝇类害虫关系较近。高温胁迫后BD1表达量有所下调,而BD2的表达显著上调,说明BD2与桔小实蝇抗热胁迫有直接关系,而BD1可能是在其他生理活动中发挥作用。克隆获得的Hsp60家族热激蛋白Hsp60在GenBank中的登录号为JF812645,基因cDNA全长2042bp,开放阅读框1722bp,编码573个氨基酸,具有分子伴侣Chaperonins cpn60的签名序列AAVEEGIVPGGG。含有典型的顶区、赤道区和中间区三个区域和两个ATP/ADP结合位点以及一个Mg2+结合位点和一个底物结合位点,C-端有Hsp60家族特有的(GGM)n重复区域。系统发育树结果表明,Hsp60和包括果蝇类的双翅目害虫关系较近。热胁迫后Hsp60基因mRNA表达量显著升高,说明它参与了桔小实蝇抗热胁迫反应并发挥着重要的作用。4.桔小实蝇抗氧化酶基因的克隆、序列分析和mRNA表达模式解析利用桔小实蝇转录组序列信息,通过RACE技术,克隆获得了1条过氧化物酶(POD)的全长cDNA序列,命名为BdpoxA1,在GenBank中的登录号JN003585。BdpoxA1基因cDNA全长2549bp,开放阅读框2106bp,编码701个氨基酸,具有1个活性位点、1个过度稳定位点和6个金属(钙)特征位点以及4个二硫化物特征序列区域。系统发育树结果表明,它首先和丽蝇蛹金小蜂Nasonia vitripennis聚为一支,然后又与双翅目的致倦库蚊Culex quinquefasciatus聚在一起。由此推断,桔小实蝇与丽蝇蛹金小蜂较近的亲缘关系可能是丽蝇蛹金小蜂在和寄主丽蝇类昆虫的协同进化中,基因发生了趋异进化,从而更有利于自身对丽蝇类昆虫的寄生。测定结果表明,热胁迫后的BdpoxA1的mRNA表达量和酶活性的表达量变化趋势一致,即35℃条件下表达上调,其他各温度条件下都略微下调,这说明BdpoxA1编码的过氧化物酶可能是一种组成性的蛋白质,不论是在逆境还是正常条件下,都能稳定地分解桔小实蝇体内的H2O2。同样的方法克隆得到一条超氧化物歧化酶(SOD)的全长cDNA序列Bdsod1,它在GenBank中的登录号为JQ713828。Bdsod1基因cDNA全长946bp,开放阅读框807bp,编码268个氨基酸,具有1个Cu/Zn.SOD签名序列GNAGERIACGII和6个活性位点。系统发育树分析表明,Bdsod1和地中海实蝇聚为一支,具有较近的亲缘关系,这与传统上的分类关系是一致的。在热胁迫下,Bdsod1mRNA表达水平上调,结合酶活性的升高,表明更多的超氧化物歧化酶催化超氧阴离子的歧化反应,充分反映了SOD在桔小实蝇抗热胁迫响应中的重要意义。综上所述,本研究基于全球气候变暖这一特点,围绕生物和环境温度变化之间的关系,以重要果蔬害虫桔小实蝇为研究对象,从生理生化和分子生物学水平全面、系统地研究了环境极端温度对桔小实蝇的影响以及桔小实蝇抗环境热胁迫的分子响应机制。首先,通过研究桔小实蝇在热胁迫下抗氧化酶系统的活性变化,明确了抗氧化酶的作用机制。其次,在成功建立桔小实蝇成虫总蛋白双向电泳技术体系的基础之上,通过差异蛋白质组学研究,明确了在热胁迫下桔小实蝇体内蛋白质的变化模式和表达水平,并确定了主要的响应蛋白质的种类和功能。最后,克隆了相关的4条热激蛋白Hsps和2条抗氧化酶基因全长cDNA序列,并利用实时定量qPCR技术探讨了它们在mRNA转录水平上的表达模式,揭示了它们在枯小实蝇抗热胁迫反应中的作用机制。本研究综合运用昆虫生理生化和分子生物学前沿技术,特别是差异蛋白质组学技术,全面解析了桔小实蝇抗热胁迫的响应机制,为今后更深入的功能基因组学和功能蛋白质组学研究打下了基础,也为桔小实蝇的田间综合治理提供了理论依据,具有一定的实践指导价值。