链霉菌AM-7161(Streptomyces sp.AM-7161)能产生次级代谢产物美达霉素(medermycin)。美达霉素是一种聚酮类抗生素，具有潜在的抗菌抗肿瘤生物学活性。在美达霉素的生物合成基因簇中，med-ORF10基因是一个功能未知基因，前期研究推测其参与美达霉素合成的调控作用。本文围绕med-ORF10基因的调控机制展开初步研究，具体包括以下几个方面:　　 1.med-ORF10对靶基因的表达调控　　 前期半定量PCR实验已初步得出med-ORF10对同一基因簇中的酮基还原酶编码基因med-ORF12存在一定的调控作用。在这里我们利用实时荧光定量PCR进一步量化其调控效果:选取了美达霉素基因簇异源表达菌株CH999/pIK340（异源野生菌株）和敲除了med-ORF10的突变菌株CH999/pAYT64（异源突变菌株），提取两者的总RNA，将其反转录为cDNA，以看家基因23S rRNA基因作为内参，利用实时荧光定量PCR检测“异源野生菌株”和“异源突变菌株”中med-ORF12基因的转录水平变化。实验结果表明，med-ORF12在“异源突变菌株”中较“异源野生菌株”转录水平下降了约5倍，这与前期推测med-ORF10为一正调控基因相符，表明此基因在美达霉素合成基因簇中行使着重要的调控作用。　　 2.med-ORF10基因的原核表达和抗体制备　　 为了能进一步研究med-ORF10的调控机制，我们对med-ORF10基因进行原核表达和多克隆抗体的制备。　　 首先从含有美达霉素合成全基因簇的pIK340质粒上PCR得到med-ORF10基因，将其克隆到pT7Blue载体上，亚克隆至表达载体pET28a(+)上，转化至表达菌株BL21(DE3)中，构建了原核表达系统BL21(DE3)/pHSL79。优化诱导表达条件获得高表达的可溶性Med-ORF10蛋白，大量纯化Med-ORF10蛋白，将纯化的Med-ORF10蛋白多次免疫新西兰大白兔和昆明小鼠制备多克隆抗体，通过Westernblot检测抗体的特异性较高。　　 3.研究Med-ORF10蛋白与靶基因启动子的相互作用　　 前期实验表明，med-ORF10基因是一个正效转录调控基因，调节的靶基因之一为med-ORF12，且调控效果非常明显，但具体调控机制也还未确定。我们试图通过凝胶迁移阻滞实验(EMSA)检测Med-ORF10蛋白是否与med-ORF12的启动子区域直接结合发挥其调控作用。　　 首先得到med-ORF12启动子Pmed-ORF12片段，对其进行生物素标记。将纯化透析的Med-ORF10蛋白与标记了的Pmed-ORF12共孵育，混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;转膜后X光曝光显示，在目前条件下Med-ORF10蛋白与Pmed-ORF12无明显结合现象，推测二者可能无直接相互作用，或二者即便有直接相互作用，但结合的条件较为苛刻。