纳米材料被广泛研究用于细胞内递送不同物质,以实现体外诊断、分子影像或靶向治疗的目的。采用聚乙二醇(PEG)对不同纳米粒的表面进行修饰,可以减少纳米粒表面非特异性地结合血液中的成分,从而有效降低体内单核吞噬细胞系统(MPS)对纳米粒的快速摄取和清除,进而延长其血液循环时间。然而,PEG修饰会在一定程度上抑制纳米粒被不同细胞有效摄取。目前,发现新的生物分子来显著提高纳米粒的细胞内化依然面临巨大的挑战。受贻贝中黏附蛋白主要组成物质的启发,本论文中我们研究了通过纳米粒的表面仿生学修饰来促进细胞吞噬的工程化方法。在该策略中,我们将邻苯二酚结构共价锚定至可生物降解的纳米粒表面,由此制备的纳米粒可以更有效地被敏感和耐药的肿瘤细胞以及正常细胞吞噬内化。当纳米粒载有抗肿瘤药物时,仿生化修饰可显著增强抗肿瘤药物的体外药理活性。此外,局部注射或口服给药后,新制备的纳米粒在肿瘤局部和肠道组织呈现出明显增强的黏附性能。因此,这种仿生方法可以用来构建功能纳米材料,用于生物传感、分子成像、药物递送和细胞治疗等不同领域。方法1.载体材料的合成通过动力学控制的缩醛化反应来合成具有p H敏感性的缩醛化β-环糊精(Ac-b CD)。具体方法如下:将5 gβ-环糊精溶于100 mL DMSO中,磁力搅拌下加入80 mg对甲苯磺酸吡啶盐,搅拌3 min后,加入20 mL 2-甲氧基丙烯,室温反应3 h后加入2 m L三乙胺终止反应;产物在400 mL去离子水中沉淀,3000 rpm离心10 min收集产物,用去离子水洗涤至中性,冻干,即得Ac-bCD白色粉末。通过胺基和羧基偶联反应将多巴胺(DOPA)键合至二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-端羧基聚乙二醇(DSPE-PEG-COOH)。合成方法如下:首先将100 mg的DSPE-PEG-COOH溶解于40 mL PBS(pH 7.4)中,其中加入20 mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和67.31 mg N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC?HCl)。室温下搅拌12 h后,加入66.37mg盐酸多巴胺至反应混合物中。随后在氮气保护下搅拌24h,温度4℃。反应结束后用截留分子量(mwco)为1000da的透析袋在去离子水中透析24h,所得溶液经冷冻干燥收集产物(dspe-peg-dopa)。2.材料的结构表征通过傅里叶变换红外光谱(ft-ir)和核磁共振氢谱(1hnmr)表征dspe-peg-dopa和ac-bcd的结构。3.纳米粒的制备采用改良的纳米沉淀/自组装法制备ac-bcd纳米粒。首先,将50mgac-bcd溶解于2ml乙腈中。将卵磷脂和dspe-peg分散在0.8ml乙醇(卵磷脂与dspe-peg的摩尔比7:3),然后加入19.2ml去离子水,于65℃加热1h。将ac-bcd溶液逐滴加入(1ml/min)到前述预热的水溶液中,并温和搅拌,随后涡旋3min,再缓慢搅拌2h后,将混合物冷却至室温。16000rpm离心10min得到固化的纳米粒,去离子水洗涤三次。按照类似的方法可以制备含有不同比例的dspe-peg和dspe-peg-dopa的纳米粒。将cy5、cy7.5或紫杉醇(ptx)溶于乙腈中,按照类似方法可以制备得到cy5、cy7.5及ptx载药纳米粒。4.纳米粒的表征通过透射电镜(tem)观察各种纳米粒的形态。颗粒大小、粒度分布和表面电位由动态光散射仪(dls)测定。5.纳米粒的体外水解将一定量的纳米粒分散于ph7.4或ph5的pbs中,不同时间点观察纳米粒的水解,并测定其在500nm的透光率。6.材料的细胞毒性评价将细胞在常规培养条件下孵育12h,然后在培养基中加入不同浓度的纳米粒,共孵育一定时间,mtt法测定细胞生存率。通过originpro7拟合曲线计算半数抑制浓度(ic50)值。7.荧光显微镜观察细胞对纳米粒的摄取将小鼠黑素瘤细胞(b16f10细胞)和人乳腺癌细胞(mda-mb-231细胞)孵育24h后,用含有cy5标记的纳米粒的新鲜培养基换液,继续培养2、4、8或12h,用lysotrackerred和dil分别对溶酶体和细胞膜进行染色。pbs洗涤后,dapi染细胞核,并通过共聚焦显微镜(clsm)观察。8.流式细胞仪测定不同细胞对纳米粒的摄取量通过荧光激活细胞分选(facs)技术定量分析不同的细胞摄取纳米粒的效率。在正式实验前将b16f10、mda-mb-231、小鼠白血病单核巨噬细胞(raw264.7)和小鼠血管平滑肌(movas)细胞接种于6孔板培养24h。加入纳米粒后的细胞用pbs洗三次(ph7.4),其次是胰酶消化,以转速1000rpm离心5min,再用pbs(ph7.4)洗涤,然后制备facs细胞悬液,通过流式细胞仪定量分析细胞摄取纳米粒的量,纳米粒以cy5标记。9.不同因素对细胞摄取的影响将b16f10细胞接种于培养板,孵育24h。然后,将细胞在4oc预孵育30min或与各种抑制剂(如10μg/ml诺考达唑;5μg/ml细胞松弛素d)孵育30min,随后加入cy5标记的纳米粒。培养4h后,细胞用pbs(ph7.4)洗涤三次。之后,制备facs细胞悬液,并用流式细胞仪分析,定量计算相对摄取率。10.载有紫杉醇(ptx)的doap修饰纳米粒的体外抗肿瘤活性评价不同的肿瘤细胞在常规条件下培养24h。然后,加入不同剂量的ptx载药纳米粒,并以ptx作为对照,培养24h后,以mtt法测定细胞生存率,分别计算ic50值。11.dopa修饰纳米粒对肿瘤组织的黏附特性评价将密度为9×106个/每只小鼠的mcf-7细胞在培养基重悬后,注射于裸鼠右侧背部皮下,并注射雌二醇,以此建立mcf-7裸鼠移植瘤模型。待瘤体平均尺寸达到100-150mm3时,将荷瘤小鼠随机分为3组(n=3),瘤内分别注射cy7.5标记含0%dopa和60%dopa的纳米粒(分散于50μlpbs溶液中,浓度为10mg/ml;通过活体成像系统测定各时间点的荧光强度。72h后,处死小鼠,收集肿瘤和主要脏器进行分析。12.dopa修饰纳米粒在小鼠胃肠道的黏附性能评价将四周龄的雄性c57bl/6小鼠(16~20g)随机分为3组(n=3),实验前对小鼠禁食24h。然后,将300μl含cy7.5标记的不同纳米粒的pbs溶液(4mg/ml)以灌胃给药。12或24h后,处死小鼠,用活体成像系统测定胃、小肠和主要器官的荧光强度。结果1.ft-ir和1hnmr分析表明成功合成了预期的dspe-peg-dopa和ac-bcd;根据1hnmr谱计算得出线形缩醛与环状缩醛的摩尔比为1.65:1。2.通过改良的的纳米粒沉淀/自组装法制得了形态较好、粒径分布均匀、分散性较好、平均粒径约为200nm左右的球形纳米粒。ac-bcd纳米粒在ph5.0的pbs中的水解速率大于其在ph7.4的pbs中的。3.浓度为500μg/ml时,经dopa修饰后的纳米粒与单纯peg修饰的纳米粒(0%dopa)相比,并未显著降低b16f10和小鼠巨噬细胞raw264.7的细胞存活率。与b16f10细胞共孵育24h后,0%dopa和80%dopa的ac-bcd纳米粒有相似的剂量依赖性细胞存活率曲线,且两种纳米粒的半数抑制浓度(ic50)值之间无显著性差异。4.clsm观察结果表明,纳米粒与细胞的共孵育时间为2、4、8、12h,细胞中纳米粒的绿色荧光强度随着时间延长逐渐增大,在8h时荧光强度最大,12h时,荧光强度减弱。在不同的时间点,dopa修饰的纳米粒组中细胞均具有较强的绿色荧光强度,且在dopa含量为60%时,荧光强度最强。5.细胞在4°c预先处理的条件下,不同含量dopa修饰的纳米粒的细胞摄取量均有显著降低。同样,细胞松弛素d和诺考达唑预处理后,细胞对纳米粒的吞噬能力也受到抑制。6.不同dopa含量的ac-bcd纳米粒可以有效负载抗癌药物ptx,tem观察表明,0%dopa和60%dopa的载药纳米粒均呈规则光滑球形,粒径分布均一,未见ptx结晶;其中0%dopa载药纳米粒粒径平均值为170nm,表面电位平均值为-33mv。60%dopa纳米粒的粒径平均值为184nm,表面电位为-32mv;对应载药量分别为9.8%和9.7%。对于b16f10、hepg2、mcf-7、mda-mb-231细胞,ptx/ac-bcd载药纳米粒的体外活性强于游离ptx,且0%dopa和60%dopa修饰的ptx/ac-bcd纳米粒之间有显著性差异;计算表明,与0%dopa的载药纳米粒和游离ptx相比,60%dopa的载药纳米粒呈现显著降低的ic50值。7.在肿瘤部位注射cy7.5标记的0%dopa纳米粒24和48h后,荧光主要位于肿瘤周围。相比之下,注射cy7.5/60%dopa纳米粒组的荧光均匀分布于肿瘤部位。此外,60%dopa纳米粒组有较高的荧光强度;与0%dopa纳米粒组相比,相对荧光强度在48h时有显著差异。肿瘤组织离体成像和定量分析显示,60%dopa组的荧光强度显著高于0%dopa组。8.不同时间点进行的离体成像结果和定量分析表明,12h时60%dopa纳米粒组的胃、肠组织的荧光强度高于0%dopa纳米粒组。在24h时,60%dopa纳米粒组中胃部的荧光强度弱于0%dopa纳米粒组,而肠组织的荧光强度则高于对应的0%dopa纳米粒组,肝脏的荧光强度也强于0%dopa组。结论1.通过动力学控制的缩醛化反应合成了具有ph响应性的缩醛化β-环糊精,即ac-bcd材料;通过羧基-胺基偶联反应制备了端基dopa修饰的dspe-peg,即DSPE-PEG-DOPA。2.用改良的纳米粒沉淀/自组装法成功制备了表面修饰有不同含量DOPA的Ac-bCD纳米粒,其形态良好、粒径分布均一,且具有p H敏感性。采用不同DOPA含量修饰的纳米粒,对细胞的毒性较小,故DOPA修饰并未显著影响纳米粒的细胞毒性。3.DOPA表面修饰后的Ac-bCD纳米粒具有显著增强的细胞吞噬行为,而60%DOPA修饰的纳米粒效果最好。4.载有PTX的0%DOPA及60%DOPA的纳米粒为球形粒子,粒径分布均一,有较高的载药量。体外抗肿瘤评价表明,60%DOPA的载药纳米粒的效果显著优于0%DOPA的载药纳米粒和游离PTX。5.60%DOPA的Ac-bCD纳米粒在肿瘤与肠道组织的黏附性能显著优于0%DOPA的纳米粒。