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第一部分血管内皮生长因子(VEGF)稳定过表达肾小管上皮细胞系(HKC细胞系)的建立背景与目的血管内皮生长因子(VEGF)在维持血管内皮细胞生存、增殖及调节血管新生和重构方面有非常重要的作用。正常情况下,胎儿与成人肾组织的VEGF主要来源于足突细胞和肾小管上皮细胞,肾小管上皮细胞可分泌VEGF121和VEGF165,是肾小管-间质中VEGF的主要来源。我们以前的多次实验证实,VEGF能抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。但是实验都是采用外源性的VEGF刺激体外培养的肾小管上皮细胞(HKC),具体的作用机制还不明确。因此,我们通过建立VEGF稳定过表达HKC细胞系,模仿体内环境,使HKC细胞能同时分泌VEGF121和VEGF165,进一步探讨VEGF对TGF-β1诱导的EMT的抑制作用及其作用机制。方法全基因合成目的序列VEGF121和VEGF165,构建目的基因VEGF121到pBuDCE4.1载体的CMV启动子下,并构建目的基因VEGF165到EF-1α启动子下,同时插入抗性zeocin。测序验证含有目的序列的正确质粒编号为Z7842-2,抗性为Zeocin。采用电转仪转化细胞的方法,将Z7842-2质粒导入HKC细胞,并通过逐步用zeocin加压的方法进行筛选,最后用ELISA法检测培养液上清中VEGF浓度。结果正常HKC细胞培养液上清中VEGF浓度为112.918pg/ml,而被转入Z7842-2质粒的HKC细胞培养液上清中VEGF的浓度为1210.061pg/ml,后者的浓度是前者的10.72倍(p<0.05)。因此认为VEGF稳定过表达HKC细胞系(简称为VEGF过表达HKC细胞系)已经建立。结论成功构建VEGF稳定过表达HKC细胞系。第二部分血管内皮生长因子(VEGF)过表达对肾小管上皮间充质转化(EMT)和Smad3表达的抑制背景与目的TGF-β1主要通过TGF-β1/Smad途径发挥生物学效应,Smad蛋白是TGF-β1受体后主要的信使分子,介导TGF-β1信号从细胞膜传入细胞核。肾小管上皮间充质转化(EMT)是肾间质纤维化的重要途径。Smad3在TGF-β1诱导的EMT过程中发挥重要作用。我们多次的实验证明,VEGF能抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT。近来,我们已经成功建立了VEGF稳定过表达HKC细胞系。因此本实验的目的是探讨VEGF过表达抑制EMT和对Smad3的影响。方法将体外培养的细胞分为以下几组：A.正常HKC组,B.正常HKC加入TGF-β1(5μ/l)刺激24小时和48小时组,C.VEGF过表达HKC组,D.VEGF过表达HKC加入TGF-β1(5μg/l)刺激24小时和48小时组。Western-blot方法检测TGF-β1信号通路中的重要分子Smad2及Smad3的表达,同时用RT及Real Time PCR方法检测Smad3基因的表达情况。Western-blot方法及激光共聚焦方法检测上皮细胞的标志蛋白E-钙黏素(E-cadherin)的表达及上皮间充质转化的标志蛋白α-平滑肌动蛋白(a-SMA)表达。ELISA方法检测培养液上清中VEGF的浓度变化。40倍倒置光学显微镜下观察各组细胞在加入TGF-β1刺激不同时间后细胞形态的变化。结果B组的α-SMA的表达较A组明显增加(p<0.05)；B组的E-钙黏素明显低于A组(p<0.05)。D组的α-SMA的表达较B组下降(p<0.05),E-钙黏素较B组明显增加(p<0.05)。B组P-Smad3的表达明显高于A组(p<0.05)；D组P-Smad3的表达明显低于B组。C组Smad3的表达较A组明显减少(p<0.05), D组Smad3的表达较B组明显减少(p<0.05)。B组P-Smad3/Smad3的比值较A组明显增加(p<0.05), D组P-Smad3/Smad3的比值较B组下降(p<0.05)。40倍倒置光学显微镜下观察,正常HKC细胞呈鹅卵石样,在加入TGF-β1刺激24小时后,细胞变成梭形；在加入TGF-β1刺激48小时后,这种变化更为明显。而VEGF过表达HKC细胞也是呈鹅卵石样外观,在加入TGF-β1刺激24及48小时后,细胞形态没有明显变化。结论HKC细胞VEGF过表达能明显减弱TGF-β1诱导的EMT; VEGF的这一作用与TGF-β1信号途径中的Smad3的表达下调及磷酸化抑制有关。第三部分血管内皮生长因子(VEGF)过表达下调Smad3表达通过PI3K/AKT信号通路背景与目的肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)在肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用,是肾间质纤维化的重要机制之一。TGF-β1/Smad信号通路在EMT过程中发挥关键作用,而Smad3是TGF-β1/Smad信号通路的关键调节因子。我们的多次研究表明,VEGF能抑制TGFβ1诱导的肾小管EMT。 PI3K/Akt信号通路是VEGF发挥作用的主要通路之一。LY294002是PI3K活性的特异性抑制剂。我们已经成功建立了VEGF过表达HKC细胞系。本部分实验的目的是,探讨VEGF过表达可否通过PI3K/Akt信号通路抑制Smad3的表达,从而抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT。方法将体外培养的细胞分为以下几组：.A组：正常HKC组；B组：正常HKC加入TGF-β1(5μg/l)刺激刺激24小时及48小时组；C组：VEGF过表达HKC组；D组：VEGF过表达HKC加入TGF-β1(5μg/l)刺激24小时及48小时组；E组：VEGF过表达HKC加入TGF-β1(5μg/l)及LY294002(20μmol/l)刺激24小时及48小时组。Western Blot法检测各组细胞磷酸化的PI3K (P-PI3K)、PI3K、磷酸化的Akt、Akt、磷酸化的Smad3、Smad3、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及E钙黏素(E-cadherin)的表达。荧光实时定量PCR (real time PCR)方法检测Smad3基因的表达情况。激光共聚焦检测α-SMA及E-cadherin的表达情况。倒置光学显微镜下观察细胞形态学的变化。结果C组PI3K的表达较A组增加(p<0.05)；C组的PI3K在P55位点的磷酸化水平较A组增加(p<0.05)；VEGF过表达HKC加入TGF-β1刺激48小时的P-PI3K较正常HKC加入TGF-β1刺激48小时明显增加(p<0.05)；E组磷酸化的PI3K水平,较其他组明显下降(p<0.05)(除A组外)。AKT的表达除了正常HKC细胞加入TGF-β1刺激48小时较低之外,其他组的表达量没有明显不同。D组磷酸化的AKT表达水平较B组明显升高(p<0.05),E组磷酸化的AKT表达水平较D组明显下降(p<0.05)。C组的Smad3基因及蛋白表达较A组减少(p<0.05)；D组Smad3基因及蛋白表达较B组减少(p<0.05)；但是,E组的Smad3基因及蛋白表达较D组升高(p<0.05)。B组的P-Smad3的表达及P-Smad3/Smad3值较A组明显增加(p<0.05)；D组的P-Smad3的表达及P-Smad3/Smad3值较B组减少(p<0.05)；E组的P-Smad3的表达及P-Smad3/Smad3值较D组增加(p<0.05)。B组的a-SMA较A组和D组明显增加(p<0.05),但VEGF过表达HKC加入TGF-β1刺激48小时组的α-SMA较正常HKC加入TGF-β1刺激48小时组明显增加(p<0.05)。A组的E-cadherin明显高于B组(p<0.05),但低于C组(p<0.05)；VEGF过表达HKC加入TGF-β1刺激24小时组的E-cadherin明显低于VEGF过表达HKC细胞加入TGF-β1及LY294002刺激24小时组(p<0.05)。正常HKC细胞及VEGF过表达HKC细胞呈鹅卵石样,在加入TGF-β1刺激24小时后,细胞变成梭形；在加入TGF-β1刺激48小时后,这种变化更为明显。VEGF过表达HKC细胞在加入TGF-β1刺激后,细胞开始有轻度变成梭形细胞的趋势,但变化不甚明显。VEGF过表达HKC细胞加入TGF-β1及LY294002刺激后细胞变为梭形。结论VEGF过表达能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HKC细胞发生EMT,其作用机制可能与VEGF通过PI3K/Akt信号通路抑制TGF-β1信号通路中Smad3表达及磷酸化有关。第四部分血管内皮生长因子(VEGF)过表达抑制肾小管上皮间充质转化(EMT)与miRNA192表达变化的关系背景与目的TGF-β1诱导的肾小管上皮间充质转化(]EMT)在肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用。据前述报道,VEGF能抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT,并且VEGF主要通过PI3K/Akt信号通路抑制Smad3的表达与磷酸化,从而抑制EMT,但其机制不明确。近来报道,miR-192与肾脏纤维化密切相关。本部分研究目的是探讨miR192在VEGF抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT过程中的调控作用。方法将体外培养的细胞分为以下几组：A.正常HKC组,B.正常HKC加入TGF-β1(5μg/l)刺激24小时及48小时组,C.VEGF过表达HKC组,D. VEGF过表达HKC加入TGF-β1(5μg/l)刺激组刺激24小时及48小时组,E. VEGF过表达HKC加入TGF-β (5μg/l)及LY294002(20μmol/l)刺激24小时及48小时组；荧光实时定量PCR (real time PCR)方法检测miR192及Smad3基因的表达情况；采用SPSS11.5软件对miR192和Smad3基因的表达进行相关分析。结果正常HKC细胞在加入TGF-β1刺激48小时后,miR192的表达较A组明显增加(p<0.05)；VEGF过表达HKC细胞在加入TGF-β1刺激48小时后,miR192的表达较正常HKC细胞加入TGF-β1刺激48小时后明显降低(p<0.05)；VEGF过表达HKC细胞在加入TGF-β1及LY294002刺激24小时后,miR192的表达较VEGF过表达HKC细胞加入TGF-β1刺激24小时后明显增加(p<0.05)。B组Smad3基因的表达较A组明显升高(p<0.05)；C组Smad3基因的表达较A组降低(p<0.05)。D组的Smad3基因的表达较B组明显降低(p<0.05)。但是,E组Smad3基因的表达较D组明显升高(p<0.05)。Smad3基因与1niR192的表达呈中高度正相关。结论在人肾小管上皮细胞中,TGF-β1能明显促进miR192表达；而VEGF能抑制miR192和Smad3的表达。Smad3基因表达与miR192勺表达呈中高度正相关。