研究背景：头面部软骨缺损是整形外科常见的疾病,采用组织工程技术修复头面部软骨缺损具有广阔的临床应用前景。然而,这项技术至今并未真正应用于临床,主要瓶颈在于工程化软骨在具有完整免疫力的大动物体内构建稳定性很低并无法长期存活。究其原因,构建软骨最常用的PGA/PLA支架材料在体内快速降解引起的无菌性炎症反应是干扰大动物体内软骨再生的主要原因,并且这是一种以巨噬细胞参与为主的固有免疫反应。因此,解决问题的关键在于如何有效地抵抗或避免这种以巨噬细胞参与为主的固有免疫反应。首先,大量文献报道,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)除具备基本的干性和低免疫原性外,还对机体多种免疫细胞具有免疫调节作用。那么,由BMSCs构建的工程化软骨是否具有抑制以巨噬细胞介导的固有免疫反应,从而改善其在大动物体内的形成质量需要进一步探索；此外,优化体外构建技术,通过延长体外培养时间促进PGA/PLA的降解,或单纯应用软骨细胞的方式构建软骨以避免材料引起的炎症反应,是否能有效改善工程化软骨在大动物体内的组织形成也需要进一步探索。研究目的：1.明确不同种子细胞及应用方案在大动物皮下的构建效果2.明确基于BMSCs构建的组织工程软骨对巨噬细胞的免疫调节作用,并探讨其相关机制。3.明确PGA/PLA体外残留量对工程化软骨在大动物皮下软骨形成的影响4.明确应用单纯软骨细胞膜片构建的软骨在大动物皮下的组织形成质量研究方法和结果：1.基于PGA/PLA的组织工程软骨在大动物体内构建稳定性的研究1.1 不同种子细胞构建的组织工程软骨在大动物体内转归的研究方法：将猪耳廓软骨细胞、BMSCs以及两者1：1混合分别接种至PGA/PLA支架材料构建工程化软骨,体外培养8周后取材,首先进行组织学、生物学及生物力学检测,并回植入猪自体皮下,规定时间内取材,比较不同时期三者在猪自体皮下软骨形成质量及炎症反应。结果：猪耳廓软骨细胞、BMSCs以及1：1混合复合PGA/PLA支架,体外培养8周后均能形成良好的软骨组织,组织学、总胶原及杨氏模量方面无明显差异。将三者植入猪自体皮下后2周,BMSCs组维持了完整的软骨结构,1：1组和软骨细胞组均遭到不同程度的破坏；体内植入后8周,BMSCs组仍可见部分软骨组织,1：1和软骨细胞组遭到严重破坏。1.2 BMSCs构建的组织工程软骨对巨噬细胞极化作用的研究方法：耳廓软骨细胞、BMSCs以及1：1混合复合PGA/PLA支架,以单纯PGA/PLA支架为对照,体外培养8周后植入猪自体皮下,定期取材,比较各组体内多核异物巨细胞数量以及巨噬细胞CD68和CD206的表达。同时,将上述三组体外培养8周后的工程化软骨与激活的巨噬细胞以transwell勺方式共培养24小时,采用免疫荧光、Real time PCR、Elisa等方法检测巨噬细胞免疫表型的改变。结果：多核异物巨细胞和CD68阳性巨噬细胞在BMSCs组浸润最少,PGA/PLA支架组最高,1：1和软骨细胞组无明显差异；M2型巨噬细胞特异表面标志CD206在BMSCs组表达最高,PGA/PLA支架组最低。体外共培养模型进一步验证BMSCs构建的工程化软骨与巨噬细胞共培养后高表达CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子,低表达IL-1β和TNF-α等促炎因子,提示BMSCs构建的工程化软骨具有促进巨噬细胞向M2型极化的作用。1.3 PGA/PLA残留量对工程化软骨在大动物体内软骨形成的影响方法：分别以软骨细胞和BMSCs为种子细胞复合PGA/PLA,体外培养8周、12周、16周,比较体外培养不同时间点形成的工程化软骨在组织学、生物学水平的差异,并计算体外PGA/PLA残留量、残留PGA直径。对比体外培养不同时间点后植入猪自体皮下2周、8周所对应的软骨形成及炎症反应。结果：分别应用软骨细胞和BMSCs构建的工程化软骨延长体外培养时间,可见PGA/PLA残留量逐渐减少,残留PGA直径逐渐变细,植入猪自体皮下后2周,体外12周和16周组软骨形成均较体外8周组好,但在植入后8周,各组工程化软骨均遭到破坏。不同培养时间的BMSCs组在植入后2周均维持了完整的软骨形态,但体外12周和16周组在体内软骨形成厚度明显大于8周组。2.应用单纯软骨细胞膜片在大动物体内再生软骨组织的研究方法：将P3代猪耳廓软骨细胞以超高密度“细胞堆积”的方法形成软骨细胞膜片,体外培养12周,组织学检测膜片形成质量,并植入猪自体皮下,观察植入后2周、8周、24周再生软骨的形成情况。结果：软骨细胞通过超高密度“细胞堆积”的方法可以在体外形成均质的和具有一定厚度的软骨细胞膜片,植入猪自体皮下后未见明显炎症反应,软骨细胞膜片逐渐成熟并能长期存活,体内24周组织学结构与正常软骨组织相似。研究结论：1.单纯耳廓软骨细胞、BMSCs、以及耳廓软骨细胞与BMSCs (1:1)复合PGA/PLA支架材料在成软骨诱导液作用下体外培养8周均能构建出优质的软骨组织,将三组工程化软骨植入猪自体皮下,仅BMSCs组在植入后2周维持了完整的软骨结构。2.基于BMSCs构建的工程化软骨具有促进M2型巨噬细胞极化从而抑制炎症反应,改善工程化软骨在大动物皮下的组织形成质量。同时,通过体外共培养模型进一步验证BMSCs构建的工程化软骨是通过促进CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子的合成,降低IL-1β和TNF-α等促炎因子的合成完成巨噬细胞M2型的极化。3.工程化软骨在体外培养至16周,PGA仍不能完全降解。PGA/PLA体外残留量会影响工程化软骨在猪自体皮下早期的软骨形成。体外培养时间越长,PGA/PLA残留量越少,体内2周的软骨形成越好。4.软骨细胞膜片因不含外源性材料,避免了材料引起的炎症反应对软骨形成的影响,植入猪自体皮下后可形成均质、成熟的软骨组织,并可长期存活。