特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是有遗传基础的,以剧烈瘙痒、皮肤干燥和皮疹为特征的慢性、反复性、炎性皮肤病[1]。许多患者自婴幼儿期发病,迁延致成年。该病反复发作,病发时,瘙痒难耐,患者身心均受折磨,严重影响生活质量。流行病学调查显示,近年来我国人群中AD的患病率呈现上升趋势[2]。目前,该病治疗方案是在患者教育和基础皮肤护理、恢复皮肤屏障功能的基础上,施以外用药物治疗结合系统治疗。外用药物治疗以局部外用糖皮质激素为治疗AD的一线疗法,而糖皮质激素长期使用会引起包括局部与全身反应在内的多种不良反应,研制治疗AD的安全高效的外用制剂成为亟待解决的问题。中医治疗AD有着悠久的历史,中药具有多成分、多靶点、多途径、综合作用特点,采集中药验方,结合现代制药工艺,研发药物是现代中药研发的重要手段。课题组以《疡科心得集》所载“苦参汤”化裁而来的中药验方为基础,引入雷公藤多苷,辅以乳膏基质,制得“参蛇乳膏”。本研究分两部分,第一部分为质量标准研究,运用科学有效的检测手段,建立参蛇乳膏质量标准,用以保证药品质量;第二部分为初步药效学研究内容,运用两个不同类型小鼠AD模型,评价参蛇乳膏治疗AD的疗效,了解药物作用特点,探索药物作用机制。第一部分参蛇乳膏的质量标准研究方法1.采用薄层色谱法鉴别乳膏中苦参、蛇床子、黄柏、地肤子、土茯苓。苦参以苦参碱、蛇床子以蛇床子素、黄柏以盐酸小檗碱、地肤子以地肤子皂苷Ic、土茯苓以落新妇苷为对照品,制备供试品、阴性对照品,点于硅胶G板上,以对应展开剂展开,显色。2.依2015版药典制剂通则乳膏项下规定,检查参蛇乳膏性状、粒度、装量差异、微生物限度。3.采用HPLC法,检测参蛇乳膏中蛇床子素含量。色谱条件为:Ultisil Top-C18(250mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-水(65:35,v/v);流速:1.0 ml·min-1;检测波长:322nm;室温;进样量:20μl。4.采用LC-MS/MS法,检测参蛇乳膏中雷公藤甲素含量。色谱条件:采用Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(73:27,v/v)。质谱条件为使用ESI,MRM,在正离子检测模式下监测雷公藤甲素和甲硝唑离子。结果1.药材薄层色谱中,在薄层板对照品相应位置,供试品均显示相同斑点,且阴性对照品未显色。2.参蛇乳膏3批样品性状均为浅黄色均匀半固体,光滑细腻,无酸败变质,无油水分离;显微镜下观察,均未发现凝聚现象,未检出大于180μm的粒子;每个批次平均装量均大于标示装量(15g),单个装量均大于标示装量93%(13.95g);霉菌、需氧菌、酵母菌三种菌总数均小于102 cfu?g-1,未检出金葡菌、活螨和铜绿假单孢菌。3.蛇床子素在5.04~80.64μg·ml-1范围内呈良好线性关系,专属性强,进样精密度RSD为0.21%,平均回收率为99.36%,重复性RSD为0.51%,8h内检测5次,检测结果RSD为0.29%。4.雷公藤甲素在10.2~510ng·ml-1范围内呈良好线性关系,专属性强,进样精密度RSD为2.62%,日间精密度RSD为2.98%,平均回收率为96.87%,重复性RSD为3.35%,12h内检测5次,检测结果RSD为2.55%。结论1.采用薄层色谱法鉴别乳膏中苦参、蛇床子、黄柏、地肤子、土茯苓5味药材,操作简便、分离快速、成本低廉,鉴别对象选择上具有代表性,各药材鉴别成分的选取上兼顾化学成分的专属性,药理活性的代表性,技术检测的可行性,可作为乳膏定性鉴别方法应用。2.参蛇乳膏性状、粒度、装量、微生物限度等检查均达到药典标准,反映出该制剂基质选择合理、制备工艺成熟。3.本研究建立的测定蛇床子素含量的HPLC法,灵敏、准确、重现性好,可作为乳膏含量测定方法使用。4.本研究建立的检测雷公藤甲素的LC-MS/MS法,灵敏、快速、专属性强,经方法学验证,精密度、准确度均达到药典要求,可作为乳膏含量测定方法使用。第二部分参蛇乳膏的初步药效学研究方法1.分别复制半抗原(OXZ)、蛋白抗原(OVA)诱导BALB/c小鼠AD模型,选择丁酸氢化可的松乳膏为阳性药物,采用皮肤炎症评分、血清Ig E浓度等指标评价。2.评价参蛇乳膏对OXZ诱导BALB/c小鼠AD模型的疗效,将小鼠随机分为4组,每组10只,设立空白对照组、OXZ模型组、阳性对照组(丁酸氢化可的松乳膏组)、参蛇乳膏组,于第1次激发结束后24h开始给药,每日1次,共15天,第6次激发后24h,观察小鼠耳部皮肤情况,对耳部炎症评分;小鼠称重;左耳直径6 mm打孔称得耳片质量;右耳组织切片,行HE染色,显微观察;小鼠眼眶采血,测定小鼠血清Ig E浓度;取小鼠胸腺、脾脏称定质量,计算脏体比。3.评价参蛇乳膏对OVA诱导BALB/c小鼠AD模型的疗效,将小鼠随机分为4组,每组10只,设立空白对照组、OVA模型组、阳性对照组(丁酸氢化可的松乳膏组)、参蛇乳膏组,于第一次激发接触后5h开始给药,持续7天,末次给药后24h,观察小鼠背部去毛区皮肤,对皮肤炎症评分;取背部实验区皮肤组织,切片,行HE染色,显微观察;小鼠眼眶采血,测定小鼠血清Ig E浓度;采用瑞氏染色法染色,对血中淋巴细胞计数。结果1.OXZ模型组小鼠耳廓肿胀,增厚呈苔藓样改变,血管充血清晰可见,表面有鳞屑、抓痕,耳部炎症评分增高,耳片质量增加,血清Ig E浓度升高;OVA模型组小鼠背部皮肤红斑、水肿,部分表皮剥脱,结痂、脱屑,皮肤炎症评分增高,血清Ig E浓度升高;丁酸氢化可的松乳膏组小鼠皮肤炎症减轻、炎症评分降低,血清Ig E浓度降低。2.基于OXZ诱导BALB/c小鼠AD模型实验可见,参蛇乳膏组小鼠耳部炎症减退,炎症评分降低,耳片质量减轻,血清Ig E浓度降低,脾脏指数降至正常,未出现丁酸氢化可的松乳膏组小鼠出现的耳朵变小、皮肤变薄,胸腺指数、脾脏指数显著降低的现象,两治疗药物均不影响小鼠体重。3.基于OVA诱导BALB/c小鼠AD模型实验可见,参蛇乳膏组小鼠耳部炎症减退,炎症评分降低,血清Ig E浓度降低,淋巴细胞计数升高,与丁酸氢化可的松乳膏组相比未见统计学意义。结论1.OXZ、OVA诱发BALB/c小鼠皮炎,炎症明显,Ig E水平升高,符合AD临床特征,证明使用OXZ、OVA诱导小鼠AD具有可复制性;丁酸氢化可的松乳膏对诱发的小鼠炎症有治疗作用,证明模型病理损伤程度适中,具有可逆转性。由此判定OXZ、OVA诱导小鼠AD模型复制成功。2.参蛇乳膏对两种不同致敏原诱导的小鼠AD模型均有显著疗效,药效与丁酸氢化可的松相当,却并未出现糖皮质激素引发的不良反应,提示该药在治疗AD方面具有广阔的前景。3.参蛇乳膏能降低致敏物所致IgE升高,改善致敏物所致淋巴细胞减少状况,使肿大的脾脏恢复正常,提示可稳定免疫系统,保护免疫器官,具有免疫调节作用,但作用机制、作用路径、物质基础等均未明确,需做进一步的验证与探讨。