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[研究背景]急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种危及危重患者生命的临床疾病,其主要特点是肺内强烈的炎症反应。研究发现在ALI/ARDS中,中性粒细胞大量聚集,分泌炎症介质与细胞因子,持续活化造成炎症联级反应,同时也会有中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracelluar traps,NETs)的产生。NETs是一种新型的中性粒细胞抗菌方式,但异常存在的NETs可以造成自身组织和器官损伤。研究表明,在急性肺损伤后,NETs的产生与炎症介质等的相互作用,可能直接加剧急性肺损伤的损伤程度。Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)是天然免疫系统关键的模式识别受体,可在多种免疫细胞中表达,在机体的免疫应答、炎症反应及组织修复等方面发挥重要的作用。且急性肺损伤是全身失控性炎症反应的结果,因此,TLR9可能成为急性肺损伤治疗的潜在靶点。近年来的研究显示,NETs的形成依赖于从应激或损伤细胞中释放的DA、MPs,而DA、MPs可能通过TLR9依赖途径产生网状结构,加重机体损伤程度。然而,TLR9在急性肺损伤中作用尚不完全明确,TLR9对LPS诱导急性肺损伤中NETs形成的作用尚不清楚。[研究目的]探究TLR9在急性肺损伤过程中的作用;探究TLR9对LPS诱导急性肺损伤中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的作用。[研究方法]1.构建TLR9基因敲除小鼠并对其表型进行初步鉴定首先利用CRISPR/Cas9技术建立TLR9基因敲除小鼠模型。利用毛细管凝胶电泳技术与PCR产物测序分析进行基因型鉴定。使用qRT-PCR和Western blot及免疫组织化学技术对TLR9敲除效果鉴定。通过检测TLR9基因敲除小鼠的遗传性状、体重及血常指标,苏木精—伊红(H-E)染色观察小鼠组织的病理形态学变化对TLR9基因敲除小鼠表型进行初步分析。2.TLR9敲除对中性粒细胞免疫功能的影响分离TLR9+/+与TLR9-/-小鼠骨髓源中性粒细胞并鉴定,TLR9激动剂CpGODN刺激中性粒细胞,qRT-PCR检测中性粒细胞炎性因子、趋化因子表达情况。利用qRT-PCR与Western blot分别检测中性粒细胞中及细胞上清MMP8、MMP9等脱颗粒的释放。Western blot方法检测TLR9敲除对中性粒细胞中MAPKs信号通路的影响。3.构建LPS诱导急性肺损伤小鼠模型,TLR9敲除对LPS诱导急性肺损伤中NETs形成作用的探究TLR9+/+与TLR9-/-小鼠通过腹腔注射LPS构建急性肺损伤小鼠模型,监测小鼠的生存期。肺组织的H&E染色、病理学评分及干湿比重测定检测TLR9敲除对急性肺损伤小鼠肺部组织病理形态及干湿比重的影响。qRT-PCR检测TLR9敲除对急性肺损伤小鼠肺组织中促炎细胞因子及趋化因子表达的影响。为探究TLR9敲除对急性肺损伤小鼠肺组织中NETs生成的影响,使用qRT-PCR和Western blot、免疫组化检测肺组织中PAD4的表达,Western blot、免疫荧光染色检测肺组织中Cit-H3的生成。分离TLR9+/+与TLR9-/-骨髓源中性粒细胞,PMA、A23187、LPS作为NETs诱导剂刺激中性粒细胞。免疫荧光染色、Western blot检测Cit-H3的生成情况,qRT-PCR和Western blot检测PAD4的表达情况,从体外来探究TLR9敲除对中性粒细胞NETs生成的影响。[研究结果]1.成功构建TLR9基因敲除小鼠,TLR9基因敲除小鼠的脾、肝组织TLR9 mRNA及蛋白质水平表达显著低于野生型小鼠;TLR9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,体重、外周血血常规各项指标均正常且组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。2.从TLR9+/+与TLR9-/-小鼠骨髓中分离PMN并鉴定,检测发现成功提取纯化出小鼠骨髓源PMN,TLR9-/-PMN细胞中TLR9在mRNA和蛋白水平上表达缺失。进一步检测PMN的相关免疫功能,结果表明TLR9敲除可降低中性粒细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、趋化因子IL-8及脱颗粒活性MMP8、MMP9的表达。且TLR9敲除抑制MAPK信号通路p38 MAPK、ERK1/2的激活。3.LPS构建ALI/ARDS小鼠模型,TLR9+/+小鼠相比于TLR9-/-小鼠表现为发病更早,死亡率更高;且TLR9敲除可显著减轻LPS引起急性肺损伤后的肺组织病理改变、炎症细胞浸润、肺组织出血,降低肺组织湿干重比(P<0.05),降低急性肺损伤肺组织中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α以及趋化因子IL-8、MCP-1的表达。进一步探究TLR9敲除对急性肺损伤中NETs生成的影响,qRT-PCR、Western blot及免疫组化结果表明TLR9-/-小鼠与TLR9+/+小鼠相比,肺组织中PAD4和Cit-H3的表达量低。免疫荧光检测结果发现,LPS组与PBS对照组相比,肺组织中Cit-H3的生成量显著增加,且LPS处理后TLR9-/-小鼠相比于TLR9+/+小鼠Cit-H3的生成量明显减少。NETs诱导剂刺激中性粒细胞后,通过免疫荧光、qRT-PCR和Western blot检测结果表明TLR9的敲除可抑制中性粒细胞NETs的生成。[研究结论]1.成功建立TLR9基因敲除小鼠模型。2.TLR9敲除可抑制中性粒细胞的免疫功能。3.TLR9参与急性肺损伤的发病过程,TLR9敲除可减少中性粒细胞NETs的产生调节脂多糖诱导的急性肺损伤,可能是防治急性肺损伤的潜在新靶点。