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研究背景和目的胆囊癌是恶性程度很高的消化系统肿瘤,据统计绝大多数胆囊癌病人生存时间小于一年,五年存活率也不到5%。胆囊癌的治疗目前仍然非常困难,主要是没有有效的药物能控制肿瘤的生长,进展期和晚期胆囊癌治疗效果很差,使得存活率得不到有效提高。对其基因及分子机制研究目前仍非常有限。我们试图通过对多个与肿瘤发生发展相关基因的检测,筛选出在胆囊癌上调表达的基因,研究它在胆囊癌发展中的作用及可能的分子机制,以期为胆囊癌患者的诊断、预后判断及治疗,提供新的靶标。研究方法首先,明确TUBB3的表达及临床意义:采用qRT-PCR方法检测了 5例正常胆囊组织及15例胆囊癌组织中TUBB3 mRNA水平的表达变化,并通过Western Blot的方法检测了 2例正常胆囊组织及10例胆囊癌组织中TUBB3蛋白水平的表达差异,后进一步扩大样本量,采用免疫组化在5例正常胆囊和30例胆囊癌组织中检测了 TUBB3的蛋白水平。以免疫组化中TUBB3的相对表达量的中位数为界,将30例胆囊癌病人TUBB3的表达值,分为TUBB3高表达组和TUBB3低表达组。根据第7版胆囊癌TNM分期（AJCC）指南记录肿瘤分化程度、肿瘤侵袭、淋巴结有无浸润及有无远处转移等,统计分析,采用电话回访了解病人生存情况,绘制TUBB3高表达组和低表达组病人Kaplan-Meier生存曲线。同时利用我院肿瘤个体化治疗检查平台的qRT-PCR数据,分析2017年手术后的胆囊癌（10例）、胃癌（42例）和结直肠癌（43例）患者的TUBB3的相对表达量。其次,在细胞层面进行TUBB3的功能研究:采用qRT-PCR及Western Blot检测胆囊癌细胞系GBC-SD、OCUG、SGC-996,NOZ和正常人肝内胆管上皮细胞系HIBEC中TUBB3的mRNA以及蛋白表达水平。构建慢病毒稳转敲降TUBB3的GBC-SD和SGC-996,qRT-PCR及Western Blot检测敲降细胞系及对照细胞系中TUBB3的mRNA及蛋白表达水平。MTT实验检测敲降TUBB3后对GBC-SD和SGC-996增殖能力的影响。Transwell实验检测敲降TUBB3后对GBC-SD和SGC-996迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞技术检测稳转敲降TUBB3后胆囊癌细胞GBC-SD和SGC-996细胞凋亡率及细胞周期的变化,同时Western Blot检测敲降细胞系及对照细胞系中周期相关蛋白p21,cyclinD1以及cyclinB1的表达变化。然后,我们通过给裸鼠皮下注射GBC-SD和SGC-996,稳转敲降TUBB3的GBC-SD和SGC-996及对照组细胞,8周内观察肿瘤的成瘤情况。最后,Western Blot检测在GBC-SD和SGC-996中敲降TUBB3后Akt/mTOR信号通路中关键分子的表达变化,同时在注射亲本细胞、稳转敲降TUBB3细胞、及对照组细胞成瘤的瘤体组织内,分别采用Western Blot检测Akt/mTOR信号通路中的关键分子的表达变化。研究结果1.预实验证实TUBB3 mRNA在15例胆囊癌组织中的表达水平显著高于5例正常胆囊组织。同时在2例正常胆囊组织及10例胆囊癌组织中检测发现TUBB3蛋白水平也在癌组织中高表达,后进一步扩大样本量,在5例正常胆囊和30例胆囊癌组织中采用免疫组化检测TUBB3的蛋白表达水平,进一步证实了预实验结果。以免疫组化中TUBB3的相对表达量的中位数值为界,将30例胆囊癌病人分为TUBB3高表达组和TUBB3低表达组。结合临床病理资料及随访病人的生存情况,分析发现TUBB3高表达组较低表达组肿瘤细胞分化差（p=0.007）,肿瘤侵袭深度深（p=0.025）,临床分期晚（p=0.002）,生存时间缩短（p=0.0412）。分析我院肿瘤个体化治疗检查平台数据,结果显示胆囊癌病人组织中TUBB3的表达显著高于胃癌和结直肠癌患者。2.在细胞层面进行TUBB3的功能研究:TUBB3的mRNA以及蛋白表达水平在人胆囊癌细胞系GBC-SD、OCUG、SGC-996、NOZ中显著高于正常人肝内胆管上皮细胞HIBEC。qRT-PCR及WesternBlot实验证实敲降细胞株中TUBB3的mRNA及蛋白表达水平均较对照细胞明显降低。接下来我们通过MTT实验检测了稳转敲降TUBB3的胆囊癌GBC-SD和SGC-996值细胞增殖能力较对照组细胞显著降低。通过Transwell实验检测了稳转敲降TUBB3的胆囊癌细胞GBC-SD和SGC-996细胞的迁移和侵袭能力较对照组细胞明显降低。通过流式细胞技术分别检测了稳转敲降TUBB3的胆囊癌细胞GBC-SD和SGC-996凋亡率与对照组相比明显升高,稳转敲降TUBB3的胆囊癌细胞GBC-SD和SGC-996与对照组相比,S期细胞减少,G2期细胞显著增多,同时qRT-PCR及Western Blot检测稳转敲降TUBB3的胆囊癌细胞GBC-SD和SGC-996与对照组相比,cyclinD1的mRNA及蛋白表达水平均降低,p21、cyclin B1的mRNA及蛋白表达均显著升高。3.最后,我们在活体动物层面探索TUBB3的功能,并初步探索其促进胆囊癌细胞生长及侵袭的分子机制。我们通过给裸鼠皮下注射胆囊癌细胞株GBC-SD和SGC-996,稳转敲降TUBB3的GBC-SD和SGC-996胆囊癌细胞及对照组细胞,8周内观察肿瘤的成瘤情况,发现敲降TUBB3组裸鼠种植肿瘤体积较亲本细胞组和对照组明显缩小。并通过Western Blot在胆囊癌细胞系GBC-SD和SGC-996、稳转敲降TUBB3的胆囊癌细胞GBC-SD和SGC-996及对照组细胞中检测,发现敲降TUBB3组细胞及移植瘤瘤体组织中pAkt及pmTOR的表达均显著降低。结论1.TUBB3在胆囊癌患者组织及细胞株中均显著过表达,并与患者的肿瘤侵袭深度深、临床分期晚及生存期缩短有关。2.TUBB3表达下调后抑制了胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进了细胞的凋亡,改变了细胞周期的分布及细胞周期蛋白的表达。TUBB3的表达下调也抑制了裸鼠移植瘤的生长。3.TUBB3表达下调后,显著降低了胆囊癌细胞系和移植瘤组织Akt和mTOR信号通路的主要蛋白磷酸化水平,提示TUBB3可能通过激活Akt/mTOR信号通路,促进胆囊癌的发生发展。4.在胆囊癌的发生发展中,TUBB3可能成为胆囊癌患者诊断、预后判断及潜在的新的治疗靶点。