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[背景]腹膜透析为终末期肾脏病患者替代治疗的重要手段之一,其主要并发症是腹膜纤维化。细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的过渡沉积为腹膜透析相关性腹膜纤维化主要特点。既往研究表明,常规高糖透析液可上调致纤维化细胞生长因子如IL-6和IL-8的表达,而后两者是重要的细胞因子,可导致腹膜纤维化。
[目的]本研究通过观察川芎嗪对体外培养的人腹膜间皮细胞(humanperitonealmesothelialcells,HPMCs)在高糖及TNFα诱导后IL-6和IL-8分泌与表达的影响,进一步研究和探讨川芎嗪对HPMCs在高糖或TNFα诱导后致纤维化细胞生长因子表达的干预作用及其机制,为临床上腹膜纤维化的防治提供理论和实验依据。
[方法]取自南京大学医学院附属鼓楼医院普外科择期腹部手术患者(排除尿毒症和腹膜炎)捐献的大网膜组织,采用胰蛋白酶法分离腹膜间皮细胞进行原代培养并传代,第三代细胞用于实验,每次实验均由来自3个患者的标本进行3次独立实验。用含1％FCS的RPMI-1640培养液同步24h后,试验分高糖环境和肿瘤坏死因子α诱导的炎症环境两部分进行,分组情况如下:
①高糖环境下:HPMCs分为五组(每组设3个样本)观察:空白对照组(完全培养液),高糖(2.5％葡萄糖)诱导组,高糖(2.5％葡萄糖)加低、中、高剂量川芎嗪(10mg/L、20mg/L和40mg/L)组。采用单四唑(monotetrazolium,MTT)法检测各组间皮细胞的活性;半定量逆转录聚合酶链反应(Semi-quantitativereversetranscriptive-polymerasechainreaction,RT-PCR)法检测细胞内IL-6和IL-8mRNA表达;酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测细胞上清液中IL-6和IL-8蛋白质水平,细胞部分用二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白检测法测定细胞蛋白质含量,用以校正ELISA结果。
②TNFα诱导下:HPMCs分为五组(每组设3个样本)观察:空白对照组(完全培养液),TNFα诱导组,TNFα加低、中、高剂量川芎嗪(10mg/L、20mg/L和40mg/L)组。采用单四唑(monotetrazolium,MTT)法检测各组间皮细胞的活性;半定量逆转录聚合酶链反应(Semi-quantitativereversetranscriptive-polymerasechainreaction,RT-PCR)法检测细胞内IL-6和IL-8mRNA表达;酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测细胞上清液中IL-6和IL-8蛋白质水平,细胞部分用二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白检测法测定细胞蛋白质含量,用以校正ELISA结果。
[结果]①高糖环境下:与空白对照组比较,高糖能显著降低HPMCs活性(P＜0.01),并显著上调HPMCsIL-6和IL-8的表达(P＜0.01);与高糖诱导组比较,川芎嗪干预组HPMCs活性显著升高(P＜0.05),上清液中的IL-6和IL-8含量显著降低(P＜0.05,P＜0.01),IL-6mRNA和IL-8mRNA表达水平均显著下调(P＜0.05),且两者在蛋白和基因水平与川芎嗪呈量效关系;
②炎症状态下:与空白对照组比较,TNFα能显著降低HPMCs活性(P＜0.01),并显著上调HPMCsIL-6和IL-8的表达(P＜0.01);与TNFα诱导组比较,低剂量川芎嗪干预组HPMCs活性有所升高,但不具统计学意义(P＞0.05),中、高剂量川芎嗪干预组HPMCs活性显著升高(P＜0.05),低、中、高剂量川芎嗪干预组上清液中的IL-6和IL-8含量显著降低(P＜0.05,P＜0.01),IL-6mRNA和IL-8mRNA表达水平均显著下调(P＜0.05),且两者在蛋白和基因水平与川芎嗪呈量效关系;
[结论]川芎嗪能下调高糖或TNFα诱导后HPMCIL-6和IL-8的表达,并恢复HPMCs的活性,能保护HPMCs并减少ECM的过度沉积,从而产生预防和/或延缓腹膜纤维化发生发展的作用;