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芸薹属(Brassica)植物是杂种优势利用最为普遍的作物种类之一,其雄性不育的机理及雄性不育系选育的研究一直深受重视。但是,雄性不育产生的机制仍然是一个尚未完全解开之谜,还有许多问题需要深入研究。在国家自然科学基金委和浙江省科技厅的资助下,本实验室在前一阶段利用mRNA DD-PCR、cDNA-AFLP技术结合RACE技术,从普通白菜(B.campestris ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsen et Lee)核雄性不育两用系中成功分离得到了与白菜核雄性不育相关基因CYP86MF、BcMF1、BcMF2、BcMF3和BcMF4。对其中的BcMF3和BcMF4基因的RT-PCR分析表明,它们都只在普通白菜两用系可育株系的中蕾和大蕾中特异表达。为进一步了解BcMF3和BcMF4基因的生物学功能,将普通白菜花蕾按大小进行更细分级,首先采用Northern杂交分析对BcMF3和BcMF4在白菜中的表达特征进行了进一步的确认:接着构建了这两个基因的组成型启动子CaMV 35S的和绒毡层组织特异性启动子A9的反义RNA和RNA干涉基因沉默植物表达载体:然后将所构建的载体,采用Floral Dip法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),通过组织培养途径转化与普通白菜同属于白菜亚种的菜心(B.campestris ssp.chinensis (L.)Makino var.parachinensis(Bailey)Tsen et Lee),获得了拟南芥3个载体的共12株转基因植株、菜心10个载体的共148个转基因植株株系:随后对转基因拟南芥和菜心植株的花粉形态、花粉萌发率与活力、花粉管的伸长、果胶甲酯酶的酶活性及不同载体的转化效率进行了观察和检测,取得结果如下: (1)采用Northern blot分析了BcMF3和BeMF4基因的表达特征。结果显示,BcMF3基因只在普通白菜核雄性不育两用系(‘ZUajh97-01’)可育株的直径为1.1mm以上的花蕾中特异表达,并且在1.2～2.5mm的花蕾中强表达,而在可育株<1.2mm的花蕾、可育株的叶片和不育株的混合花蕾中均不表达;BcMF4基因在可育株1.2～2.5mm的花蕾中特异表达,而在可育株<1.2mm和>2.5mm的花蕾、可育株的叶片和不育株的混合花蕾中均不表达。表明BcMF3和BcMF4基因可能与白菜的花粉发育有关,而且主要作用在花粉成熟前后。 (2)构建了BcMF3和BcMF4基因的组成型启动子CaMV 35S的和绒毡层组织特异性启动子A9的反义RNA和RNA干涉基因沉默植物表达载体共10个,并分别将它们导入了农杆菌LBA4404菌株中。 (3)将所构建的10个载体的农杆菌菌液采用Floral Dip法转化拟南芥。通过卡那霉素筛选,得到了3个具有CaMV 35S启动子的载体pBI-B3、pBI-B4R和pBI-BB34的共12株抗性转基因植株,PCR和Suothern blot分析证明外源基因成功整合到了这些转基因植株的基因组中,同时说明