热休克蛋白家族(heat shock protein,Hsp)维持着细胞内环境稳定和蛋白质相互作用的完整,几乎存在于各种原核生物、真核生物中。在热休克蛋白的参与下,细胞中的各种DNA及蛋白分子依照生物学规律严格地执行着它们的生物学功能。葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein 75,Grp75)是热休克蛋白家族成员,在细胞中行使着分子伴侣功能,参与翻译后的肽链结合并帮助蛋白质正确折叠,参与DNA的复制、转录,参与细胞骨架的稳定、细胞内信号转导等多种生命活动。越来越多的证据表明在很多应激引起的损伤过程中,Grp75通过多个途径发挥其细胞保护功能,包括缺糖损伤。已有的研究发现,Crp75蛋白通过其253-282位氨基酸残基与p53结合,这种结合作用抑制p53核移位。而p53是细胞周期及细胞凋亡过程中的关键分子,那么Grp75对细胞的保护是否经由其与p53的结合抑制其入核,并抑制其表达实现的呢?　　为研究Grp75和p53的结合是否参与Grp75对细胞的保护过程,构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR法得到Grp75缺失突变基因,并成功构建Grp75缺失突变体特异性表达载体pcDNA3.1(+)/Grp75(A253-282)。为跟踪研究外源Grp75缺失突变体和p53是如何相互作用的,提取PC12细胞的RNA,利用逆转录酶得到PC12细胞的cDNA,以此为模板设计引物得到表达p53的DNA片段,构建其表达的真核表达载体pcDNA3.1(+)/p53。　　用脂质体将pcDNA3.1(+)/Grp75(△253-282)转染到PC12细胞株,以1mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(△253-282)(+)。半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高,结果显示Grp75(△253-282)过表达的PC12细胞株成功构建。　　对PC12细胞组、PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0h、3h、9h、18h和36h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324及姬姆萨染色法检测细胞凋亡情况。结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力均高于其它两组,PC12/Grp75(△253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义。Hoechst33324及姬姆萨染色后,存活细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致。以上结果表明Grp75基因253-282位点的缺失在一定程度上降低了其对细胞的保护作用。Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞内p53蛋白表达量高于Grp75过表达组,与PC12细胞组基本一致。　　免疫荧光检测各细胞中p53的表达及分布情况,结果显示正常培养条件下,PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组p53表达量高于PC12/Grp75(+)细胞组,接近于PC12细胞组,与Western Blot结果相一致。随着缺糖时间的延长(0h、3h、18h、36h),PC12细胞中p53的表达量明显增多,而且有明显的入核现象。PC12/Grp75(+)细胞在各缺糖培养的时间下p53蛋白表达较PC12细胞组少,证实Grp75的过表达可以抑制细胞内p53的表达。此外Grp75基因的253-282位点缺失后似乎没有使Grp75完全丧失抑制p53的入核作用。进而为证实Grp75缺失突变后是否仍然与p53有结合作用,将pcDNA3.1(+)/Grp75(△253-282)和pcDNA3.0/Grp75分别与pcDNA3.1(+)/p53瞬时转染入PC12细胞。对两种细胞进行免疫共沉淀检测,结果发现Grp75缺失突变后仍然与p53有结合作用。可能是由于Grp75缺失突变后构象发生改变与p53结合,抑或二者仍有其他结合位点。　　综上所述,Grp75蛋白对缺糖损伤的的PC12细胞的保护作用部分通过与p53的直接结合实现的,这种结合作用部分抑制p53的核移位,阻断其依赖转录的促凋亡过程;并且二者可能除253-282位这一结合位点还有其他位点。此外,Grp75的过表达可以抑制细胞中p53的表达,这一抑制作用可以减弱p53引起的促凋亡过程。