研究背景:　　 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的严重微血管并发症之一，也是糖尿病患者致残、致死的主要原因。DN的确切发病机制不明，目前认为受多方面因素的影响，包括代谢因素、血流动力学因素、氧化应激、遗传因素等。近年来慢性低度炎症及固有免疫系统的激活在DN的发病中受到越来越多的重视，多种炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18等通过自分泌和旁分泌方式导致炎症级联放大效应而参与DN发病。有学者提出把糖尿病肾脏疾病看作一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病。　　 内脏脂肪素(Visfatin)是新近识别的一种脂肪细胞因子，具有促进炎症反应和免疫调节功能，在多种不同细胞中Visfatin激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及促进炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6等的表达，参与了一大类急慢性炎症相关疾病如急性肺损伤、类风湿关节炎、动脉粥样硬化等的发病。在2型糖尿病病人中，血浆Visfatin浓度升高、是2型糖尿病的独立相关因素，并且与肌酐清除率呈负相关、与尿白蛋白排泄率呈正相关。Cha研究小组的结果更是显示遗传性2型糖尿病大鼠肾小球及肾间质Visfatin水平均比对照组大鼠升高；这些大鼠在DN早期时血浆Visfatin浓度就明显升高，并与微量白蛋白尿呈正相关；大鼠肾小球系膜细胞、足细胞、近端肾小管细胞均表达并分泌Visfatin，而Visfatin能进一步促进上述三种肾脏固有细胞表达促纤维化分子及细胞外基质，提示炎症因子Visfatin也在DN的发病中起一定的作用。而Visfatin以何种机制参与DN的发病?尚待研究。　　 大量研究表明，肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的过度激活是DN发生发展的重要机制之一。RAS的主要效应分子血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)除了血流动力学调节作用之外，还作为促生长、促纤维化及促炎因子导致肾脏功能损害，其中AngⅡ与NF-κB的相互激活介导的级联炎症反应起了关键作用。如前述，有研究显示Visfatin可激活NF-κB，而NF-κB又可激活AngⅡ，如此推断，Visfatin是否通过激活RAS通路而参与DN发病呢?系膜细胞是肾小球中功能最活跃的一类细胞，在病理状态下大量增殖，分泌炎症因子，并合成大量细胞外基质，促进肾脏病变进展。Visfatin参与DN发病，是否也对系膜细胞有直接促增殖作用呢?本课题以大鼠肾系膜细胞为模型，研究Visfatin对系膜细胞增殖及RAS表达的直接调节作用，以期从细胞增殖方面研究Visfatin对DN的致病作用及阐明局部RAS激活在Visfatin参与DN发病中的可能作用。　　 研究目的:　　 1.观察Visfatin对大鼠肾系膜细胞增殖的影响。　　 2.观察Visfatin对大鼠肾系膜细胞RAS主要成员：肾素、血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)、血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)、AngⅡ、血管紧张素Ⅱ受体1(AngⅡ type1 receptor，AT1)和血管紧张素Ⅱ受体2(AngⅡ type2 receptor，AT2)的直接调节作用。　　 研究方法:　　 1.细胞培养　　 在37℃、5％CO2环境中，用含10％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的低糖DMEM培养基培养大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，当细胞长至70％-80％融合时，改用含1％FCS的低糖DMEM同步化过夜。　　 2.重组大鼠Visfatin干预实验　　 不同终浓度(0、1、10、100、200ng/ml)Visfatin干预系膜细胞24h及100ng/mlVisfatin干预细胞不同时长(0、12、24、48h)，观察Visfatin对系膜细胞增殖影响的浓度效应及时间效应。　　 不同终浓度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin干预系膜细胞48h，观察Visfatin对系膜细胞RAS主要成员mRNA及蛋白表达影响的浓度效应。　　 不同终浓度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin干预系膜细胞48h及100ng/mlVisfatin干预细胞不同时长(0、12、24、48h)，观察Visfatin对系膜细胞培养上清液AngⅡ生成影响的浓度效应及时间效应。　　 3.CCK-8试剂盒WST-8法检测系膜细胞增殖。　　 4.Real time-PCR检测系膜细胞肾素、AGT、ACE、AT1、AT2 mRNA表达。　　 5.Western Blot检测系膜细胞AGT、AT1蛋白表达。　　 6.放射免疫法检测培养上清液中AngⅡ活性。　　 7.统计学分析　　 应用SPSS13.0软件进行统计学分析。各组正态分布的数据或经转换后呈正态分布的数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，多组间两两比较采用最小有意义差异(least significant difference，LSD)t检验。显著性水准为P＜0.05。　　 实验结果:　　 1.Visfatin对系膜细胞增殖的影响　　 系膜细胞与不同浓度(0、1、10、100、200ng/ml)Visfatin孵育24h，随着Visfatin浓度增高，细胞增殖逐渐增多，呈剂量依赖性，Visfatin浓度自10ng/ml起，与对照组相比差异具有统计学意义。　　 系膜细胞与100ng/ml Visfatin孵育不同时长(0、12、24、48h)，随着孵育时间延长，细胞增殖逐渐增多，呈时间依赖性。孵育时间自12h起，与对照组相比差异具有统计学意义；孵育时间为24h时，细胞增殖达到顶峰；延长孵育时间至48h细胞增殖不再继续增加。　　 2.Visfatin对系膜细胞肾素、AGT、ACE、AT1、AT2 mRNA表达的影响　　 系膜细胞与不同浓度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，随着Visfatin浓度增高，肾素、AGT、AT1 mRNA相对表达量逐渐升高，呈剂量依赖性，Visfatin浓度自10ng/ml起，与对照组相比差异具有统计学意义；而ACE、AT2 mRNA相对表达量在Visfatin刺激前后保持不变。　　 3.Visfatin对系膜细胞AGT、AT1蛋白表达的影响　　 系膜细胞与不同浓度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，随着Visfatin浓度增高，AGT蛋白表达逐渐升高，呈剂量依赖性，Visfatin浓度自10ng/ml起，与对照组相比差异具有统计学意义；AT1蛋白表达在Visfatin浓度为100ng/ml时与对照组相比差异具有统计学意义。　　 4.Visfatin对系膜细胞培养上清液AngⅡ生成的影响　　 系膜细胞与不同浓度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，随着Visfatin浓度增高，细胞上清液AngⅡ含量逐渐增多，呈剂量依赖性，Visfatin浓度自1ng/ml起，与对照组相比差异具有统计学意义。　　 系膜细胞与100ng/ml Visfatin孵育不同时长(0、12、24、48h)，随着孵育时间延长，细胞上清液AngⅡ含量逐渐增多，呈时间依赖性。孵育时间自12h起，与对照组相比差异具有统计学意义；孵育时间为24h时，AngⅡ含量达到顶峰；延长孵育时间至48hAngⅡ含量不再继续增多。　　 结论:　　 1.Visfatin以时间及剂量依赖方式促进系膜细胞增殖。　　 2.大鼠肾小球系膜细胞表达肾素、AGT、ACE、AT1及AT2。　　 3.Visfatin以剂量依赖方式促进系膜细胞AGT mRNA及蛋白表达，以时间及剂量依赖方式促进系膜细胞AngⅡ生成。　　 4.Visfatin促进系膜细胞肾素mRNA表达，而对ACE mRNA表达无影响。　　 5.Visfatin促进系膜细胞AT1 mRNA及蛋白表达，而对AT2 mRNA表达无影响。