多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是一种神经上皮来源的恶性程度最高、最为常见的原发性胶质瘤亚型(WHOⅣ级)。约占脑胶质瘤的25%~50%,被世界公认的一种致命的人类癌症。GBM常见于20岁以上的成年人,其中40岁-70岁最为常见,男性略多于女性,发病率约1/10万。约60%的GBM为原发性新生胶质瘤,由低级别胶质瘤的恶性演变而成的GBM约占总GBM患者的40%。最近文献报道指出被新诊断的GBM患者一般存活时间约为8~15个月,复发的GBM患者存活时间也只有3~9个月。即使手术后经过系统的放化疗,GBM患者2年生存率不超过10%,5年生存率更不到5%。目前GBM的基因治疗及靶向治疗是研究的热点,到目前为止已发现不少蛋白的异常表达与GBM的发生和进展有关,但至今尚未发现一种与之发生有关的特异蛋白,虽然对GBM的研究已有重大进展,但GBM发生的原因仍不明了。本课题组查阅大量文献,发现一种潜在的抗癌因子,发现了含MYND结构的锌指蛋白11(Zinc finger MYND domain-containing protein11,ZMYND11)。ZMYND11又称为BS69,分子量为69kDa,由ZMYND11基因合成,基因定位于细胞核内染色体10p15.3,包含15个外显子,跨度120kb。在人体和动物的多种组织器官都有不同水平的表达。最早于1995年被Hateboer等发现可与人腺病毒早期区域蛋白1A(Early region1A,E1A)特异性结合并抑制E1A蛋白的反式激活作用从而发挥其抗癌作用。有研究发现ZMYND11可通过其特有的结构域特异性识别H3.3K36me3中的H3K36me3结构,作为共因子抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性进而抑制相关致癌基因的转录。也有学者发现ZMYND11可抑制乳腺癌的发生及进展。直到目前,有关ZMYND11与GBM的研究目前尚未报道。为探讨ZMYND11对GBM的作用,我们收集GBM肿瘤标本经western检测发现ZMYND11在GBM中低表达,并通过GBM细胞系U87细胞的慢病毒转染、细胞功能学实验及体内试验发现ZMYND11可抑制GBM的发生及进展。但ZMYND11在GBM中低表达的原因目前尚不为人知。本课题组查阅文献及生物信息网站最终发现miR-196a-5p与GBM的发生与患者预后密切相关,并且极可能靶向调节ZMYND11的表达,利用双荧光素酶报道基因等实验证实ZMYND11是miR-196a-5p下游靶点。经过拯救试验我们明确miR-196a-5p可通过靶向抑制ZMYND11发挥其促肿瘤的作用。第一部分ZMYND11在多形性胶质母细胞瘤的表达及临床意义目的:对比ZMYND11在GBM肿瘤与非肿瘤脑组织中表达的差别并探讨ZMYND11表达水平与GBM患者生存时间的关系。方法:收集河北医科大学第二医院神经外科2015年1月-2016年6月多形性胶质母细胞瘤标本20例,重度颅脑外伤患者术中无肿瘤脑组织标本20例,分为肿瘤组及对照组。并对上述GBM患者术后进行随访。病理证实所取标本均为多形性胶质母细胞瘤,取Western Blot及q RT-PCR方法检测两组标本中ZMYND11的表达情况并进行比较。根据每个GBM标本ZMYND11表达水平与肿瘤组ZMYND11平均表达水平的比较情况,将上述肿瘤组的GBM患者又分为ZMYND11高表达组与低表达组,利用统计学探讨ZMYND11的表达水平与GBM患者生存时间的关系。结果:1.GBM患者临床信息及资料归纳患者临床资料:GBM患者(肿瘤组)20例,男12例,女8例,年龄44-68岁,平均年龄54.9;重度颅脑外伤患者20例(对照组)男性14例,女性6例,年龄21-65岁,平均35.78岁。GBM患者术后随访3.6-16.1个月,平均9.74个月。所有GBM患者术前均未进行任何放化疗。术后GBM患者中2例未进行放化疗,16例术后化疗,术后18例行放疗,对照组中的20例颅脑外伤的患者均无其他系统肿瘤的发生。2.ZMYND11在GBM肿瘤组织中表达显著低于正常脑组织所有纳入本研究的GBM患者均为我院病理科所证实,本课题组利用western blot及q RT-PCR检测两组ZMYND11的表达,结果显示:GBM治疗中的ZMYND11的表达水平显著低于无肿瘤脑组织。3.ZMYND11的表达水平与GBM患者的中位生存时间有关为进一步分析ZMYND11表达的临床意义,我们随访了上述20例GBM患者并得到其生存时间。将所收集的GBM标本根据其ZMYND11表达水平与肿瘤组ZMYND11平均表达水平比较,高于平均水平的标本称为高表达组,低于平均水平的称为低表达组,统计两组GBM患者平均生存时间及中位生存时间。结果发现ZMYND11高表达组的患者的中位生存时间长于低表达组,ZMYND11高表达组与低表达组平均生存生存时间无明显统计学差异(P>0.05)。小结:1.ZMYND11在GBM中呈明显低表达。2.ZMYND11表达水平与GBM患者中位生存时间存在明显正相关性,提示ZMYND11对GBM的发生及进展可能存在一定的抑制作用。第二部分ZMYND11对多形性胶质母细胞瘤的增殖、侵袭及凋亡等生物学行为的影响目的:通过建立ZMYND11过表达的U87细胞系,探讨ZMYND11对GBM细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响。方法:向人多形性胶质母细胞瘤细胞系U87细胞通过慢病转染使ZMYND11过表达,经Western blot检测转染效果后并通过CCK-8试验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染色法检测细胞凋亡比例,transwell实验检测细胞侵袭力,并通过裸鼠成瘤实验验证ZMYND11在体内对GBM生长的影响。结果:1.ZMYND11过表达的U87细胞模型建立应用ZMYND11过表达的慢病毒及空载慢病毒分别转染GBM细胞系U87细胞建立ZMYND11过表达的U87细胞系及对照U87细胞系,经Western blot实验检测两组细胞的ZMYND11表达水平,结果发现ZMYND11过表达组的ZMYND11表达水平显著高于对照组,可以进行后续的细胞功能学实验。2.ZMYND11可抑制GBM细胞的增殖经CCK-8实验检测ZMYND11过表达的U87细胞及对照细胞的不同时期的细胞活力,并绘制两组细胞增殖曲线。结果发现ZYMND11过表达的U87细胞不同时期的活力均明显低于对照组。由此推断ZMYND11可抑制GBM细胞的增殖。3.ZMYND11可抑制GBM细胞有丝分裂并促进其细胞凋亡经流式细胞术及Ⅴ-PE/7-AAD双染染色检测ZMYND11过表达的U87细胞及对照组细胞的周期变化及细胞凋亡情况,结果发现ZMYND11过表达组G0/G1期的细胞比例明显高于对照组,而且G2/M期的细胞比例显著低于对照组;在ZMYND11过表达组中的早期及中期凋亡细胞比例明显高于对照组。表明ZMYND11可抑制GBM细胞的有丝分裂并促进GBM细胞凋亡4.ZMYND11可抑制GBM细胞的侵袭力通过transwell实验检测ZMYND11过表达的U87细胞及对照细胞的侵袭力,结果显示ZMYND11过表达的U87细胞透过膜的细胞数明显少于对照组细胞,由此推断ZMYND11能抑制GBM细胞的侵袭。5.ZMYND11可有效抑制GBM的生长上述体外实验后,我们将ZMYND11过表达的U87细胞系及对照细胞置入4周大的雌性裸鼠皮下进行裸鼠成瘤实验,同样分为ZMYND11过表达组与对照组,对ZMYND11对GBM在体内生长的影响进行研究,结果发现ZMYND11过表达组的裸鼠所形成的肿瘤生长速度、肿瘤体积及肿瘤重量均小于对照组的裸鼠。此结果表明ZMYND11可在体内有效抑制GBM的生长。小结:1.ZMYND11过表达可有效抑制GBM细胞的增殖及有丝分裂。2.ZMYND11过表达可明显抑制GBM细胞的侵袭力。3.ZMYND11过表达可显著促进GBM细胞的凋亡进程。4.ZMYND11过表达可有效抑制GBM肿瘤的生长。第三部分miR-196a-5p靶向抑制ZMYND11并促进GBM细胞增殖、侵袭及抗凋亡目的:探讨miR-196a-5p在GBM中可靶向抑制ZMYND11的表达并可通过此机制促进GBM细胞增殖、侵袭及抗凋亡的研究。方法:利用Western blot及q RT-PCR方法检测所收集的GBM标本中ZMYND11与miR-196a-5p的表达水平,分析两者表达水平的相关性。取慢病毒及质粒分别转染U87细胞系以抬高或敲低miR-196a-5p的表达,并利用Western blot检测miR-196a-5p上调或下调后的ZMYND11的表达水平,验证两者表达的相互关系。为进一步证实miR-196a-5p和ZMYND11的靶向关系,本课题组设计并进行了双荧光素酶报告基因实验。此外,我们还通过慢病毒及siRNA转染U87细胞成功的建立miR-196a-5p和ZMYND11均下调的U87细胞及对照细胞系,完成了拯救试验,验证miR-196a-5p可通过抑制GBM中ZMYND11的表达而发挥其对GBM发生与进展的促进作用。结果:1.在GBM中miR-196a-5p和ZMYND11的表达呈明显负相关性。我们对利用Western blot及qRT-PCR方法分别检测所收集的20例GBM标本中ZMYND11与miR-196a-5p的表达水平,发现两者表达呈明显负相关;此外通过转染U87细胞改变miR-196a-5p表达后再检测ZMYND11的表达改变情况,结果发现miR-196a-5p与ZMYND11表达呈负相关。由此推断miR-196a-5p与ZMYND11在GBM中表达呈负相关性。2.在GBM中miR-196a-5p可靶向抑制ZMYND11的表达并通过此机制促进GBM的发生与进展。通过双荧光素酶报告基因实验本课题组发现ZMYND11野生型组的U87细胞荧光素酶活性显著低于ZMYND11突变型组,提示miR-196a-5p可特异性结合于ZMYND11的mRNA中3’UTR区并抑制ZMYND11的表达。此外,我们经慢病毒及siRNA转染U87细胞成功建立miR-196a-5p和ZMYND11均低表达的U87细胞及仅miR-196a-5p下调的对照细胞系以完成拯救试验,经Western blot检测转染效果后将两组细胞进行细胞功能学实验并发现miR-196a-5p和ZMYND11均低表达的U87细胞的增殖、侵袭与抗凋亡均高于对照细胞系,此实验证实miR-196a-5p在GBM中通过抑制ZMYND11表达从而促进肿瘤增殖、侵袭及抗凋亡。小结:1.在GBM中miR-196a-5p可靶向抑制其下游的ZMYND11的表达,导致miR-196a-5p与ZMYND11在GBM细胞中的表达呈明显负相关。2.在GBM中miR-196a-5p通过特异性的靶向抑制ZMYND11的表达从而促进GBM细胞的增殖、侵袭及抗凋亡能力。结论:1.ZMYND11在GBM中呈明显低表达,ZMYND11高表达的GBM患者中位生存时间明显长于ZMYND11低表达的GBM患者。2.ZMYND11过表达可有效抑制GBM细胞的增殖、侵袭并促进其细胞凋亡。3.在GBM中miR-196a-5p可靶向抑制下游的ZMYND11的表达从而促进GBM的细胞增殖、侵袭及抗细胞凋亡。