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研究背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)简称慢阻肺,是一种以持续性呼吸系统症状和气流受限为特征的慢性炎症性疾病。吸烟是慢阻肺最为重要的环境发病因素,并在疾病的发展过程中促进气道结构改变。上皮-间质转化(EMT)是慢阻肺小气道重塑重要的发病机制之一,表现为上皮细胞标志物表达减少,间质细胞标志物表达增加。多项研究表明,烟草提取物(CSE)可促进EMT形成,然而其具体机制并未阐明。TGF-β及其下游Smad2/3信号途径在肿瘤形成过程中既具有致癌性又具有抑制肿瘤的特性。炎性肿瘤微环境中的TGF-β既可能引起肿瘤细胞凋亡和肿瘤抑制,也可能诱导促进肿瘤细胞侵袭和转移的EMT。然而Smad2/3信号途径在吸烟引起的慢阻肺EMT形成过程中的精细调控机制还有待进一步的研究。非受体型酪氨酸激酶Lyn具有双向调节作用,其亚细胞定位可能是发挥其功能的关键。Lyn激酶在慢阻肺发生机制中的研究较少,仅有少量研究显示,阻断Lyn激酶可减轻CSE对气道上皮细胞的毒性。探索Lyn激酶在CSE诱导EMT形成过程中的作用对于寻找慢阻肺新型药物治疗靶点有着重要意义。本研究拟以CSE诱导的COPD小鼠模型及其干预的16HBE细胞为主要研究对象,探究Smad2/3信号途径在CSE诱导EMT形成过程中的作用以及Lyn激酶对Smad2/3途径的调控作用。第一章CSE诱导小鼠气道上皮-间质转化及信号转导机制目的观察CSE诱导小鼠气道EMT形成并探究相关信号转导机制方法10只C57BL/6J雄性小鼠随机均分为2组:PBS对照组和COPD模型组,采用鼻内滴注CSE和脂多糖建立COPD小鼠模型。造模完成后:(1)观察小鼠BALF细胞总数及分类计数;(2)HE和PAS染色观察小鼠肺泡破坏及气道黏液分泌情况;(3)RT-q PCR检测小鼠肺组织TGF-β1、MUC5AC m RNA表达;(4)ELISA检测小鼠肺组织TGF-β1含量;(5)免疫荧光检测小鼠气道E-cadherin、Vimentin、α-SMA表达;(6)Western blot检测小鼠肺组织E-cadherin、Vimentin、α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Lyn、p-Lyn蛋白表达。结果与PBS对照组比较:(1)COPD小鼠BALF细胞总数及中性粒细胞、巨噬细胞均增加;(2)HE染色显示:COPD小鼠肺泡平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)均明显增大;(3)PAS染色显示:COPD小鼠PAS染色阳性细胞百分比增大;(4)RT-q PCR检测显示:COPD小鼠肺组织TGF-β1、MUC5AC m RNA表达量增加;(5)ELISA检测显示:COPD小鼠肺组织TGF-β1蛋白表达增高;(6)免疫荧光检测显示:COPD小鼠气道上皮E-cadherin蛋白表达减少,荧光强度降低,Vimentin、α-SMA蛋白表达增加,荧光强度增强;(7)Western blot检测显示:COPD小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达减少,Vimentin、α-SMA蛋白表达增加,TGF-β1蛋白表达增加,p-Smad2/3、p-Lyn相对磷酸化水平增高。结论(1)COPD小鼠气道发生了黏液高分泌,气道黏液分泌以MUC5AC为主。(2)COPD小鼠气道发生了EMT,TGF-β1介导的Smad2/3信号途径可能是CSE诱导EMT形成的重要途径。(3)Lyn激酶可能参与Smad2/3途径调节CSE诱导的EMT。第二章Lyn激酶在CSE诱导16HBE细胞上皮-间质转化中的调控机制目的明确Lyn激酶在CSE诱导16HBE细胞EMT中的作用机制。方法第一部分,体外培养16HBE细胞,给予不同浓度(0%-5%)和不同时间(0h-72h)的CSE干预后,Western blot检测E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表达。第二部分,将Lyn-si RNA干预的16HBE细胞分为4个处理组:DMEM对照组,5%CSE刺激组,Lyn-si RNA+DMEM对照组,Lyn-si RNA+5%CSE刺激组;Western blot检测各组细胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3、Lyn、p-Lyn蛋白表达。第三部分,将LYN慢病毒转染的16HBE细胞分为4个处理组:GFP+DMEM对照组,GFP+5%CSE刺激组,Lyn+/++DMEM对照组,Lyn+/++5%CSE刺激组;Western blot检测各组细胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3、Lyn、p-Lyn蛋白表达。结果(1)随着CSE浓度的增加或刺激时间的延长,16HBE细胞E-cadherin蛋白表达逐渐降低,Vimentin、α-SMA蛋白表达逐渐增加,以5%CSE、刺激72h最明显。(2)Lyn-si RNA干预后:(1)与DMEM对照组相比较,5%CSE刺激72h后,E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、α-SMA蛋白表达增加,p-Smad2/3、p-Lyn相对磷酸化水平增加;(2)与单纯5%CSE刺激组相比较,Lyn-si RNA+5%CSE刺激组E-cadherin蛋白表达降低程度减小,Vimentin、α-SMA蛋白表达增加程度降低,p-Smad2/3、p-Lyn相对磷酸化水平增加程度降低。(4)LYN慢病毒转染后:(1)与DMEM对照组相比较,5%CSE刺激72h后,E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、α-SMA蛋白表达增加,p-Smad2/3、p-Lyn相对磷酸化水平增加;(2)与单纯5%CSE刺激组相比较,Lyn+/++5%CSE刺激组E-cadherin蛋白表达降低程度增大,Vimentin、α-SMA蛋白表达增加程度提高,p-Smad2/3、p-Lyn相对磷酸化水平增加程度提高。结论(1)随着CSE刺激浓度的增大或刺激时间的延长,16HBE细胞EMT逐渐加重,以5%CSE、刺激72h最显著。(2)Lyn-si RNA能抑制CSE诱导的E-cadherin表达下调和EMT,其机制与Smad2/3磷酸化水平降低有关。(3)Lyn激酶高表达能促进CSE诱导的E-cadherin表达下调和EMT,其机制与Smad2/3磷酸化水平升高有关。