一、小鼠脾NK细胞纯化、体外培养和鉴定目的:探讨小鼠NK细胞分选方法、体外NK细胞培养扩增体系的建立及体外培养对NK细胞杀伤活性的影响。方法:采用流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞亚群百分比。采用抗Thy-1.2抗体标记免疫磁珠去除T细胞及抗DX5抗体标记免疫磁珠正选NK细胞。流式细胞仪检测分选NK细胞纯度。采用含IL-2或(和)IL-15的体外培养体系,比较不同培养体系培养扩增效率。采用LDH释放法检测NK细胞杀伤活性。结果:B6成年小鼠脾脏CD3~-DX5~+NK细胞占3.0-5.5%。经磁珠两步法分选后CD3~-DX5~+NK细胞纯度高于95%。含10ng/mL rhlL-2和100ng/mL rhIL-15的DMEM完全培养基培养分选的脾NK细胞第3天、6天、9天、12天、15天时细胞计数倍数为1.27±0.05、3.14±0.18、6.23±0.28、10.81±0.92、23.10±1.44。NK细胞培养后免疫表型为CD3~-DX5~+,CD3~-DX5~+NK细胞占95.0%以上。静息NK细胞杀伤活性弱。效:靶比为10:1时NK细胞毒性为28.7%,而培养激活后效:靶比为10:1时NK细胞毒性为96.3%。结论:采用抗Thy-1.2和DX5免疫磁珠可高纯度分选小鼠NK细胞,体外含IL-2和IL-15的DMEM完全培养基可有效扩增NK细胞,联合应用可提高培养扩增效率,体外培养扩增的NK细胞免疫表型仍为CD3~-DX5~+,扩增后NK细胞杀伤活性比静息NK细胞杀伤活性高。二、建立小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD和白血病模型目的:建立B6→BALB/c小鼠异基因造血细胞移植后非致死性aGVHD模型和EL9611白血病异基因造血细胞移植模型。方法:32只SPF级BALB/c小鼠随机分为4组,各组小鼠分别接受6、7、8、9Gy X射线全身照射。C57BL/6(H-2~b,♂)小鼠为供鼠,BALB/c小鼠(H-2~d,♀)为受鼠。32只BALB/c小鼠经预处理后随机分为4组,分别尾静脉输注1×10~6、2.5×10~6、5×10~6、10×10~6个骨髓细胞重建造血。在能重建造血的基础上建立aGVHD模型,输注BMCs基础上输注5×10~6、10×10~6或20×10~6个脾细胞。6-7周龄SPF级BALB/C小鼠尾静脉接种1×10~6个EL9611细胞。接种8天后分组:无TBI对照、TBI对照、同基因BMT对照、异基因BMT组,每组8只。结果:接受6Gy剂量的小鼠全部生存。接受7Gy TBI预处理的小鼠中位生存期为28.0天,33天内全部死亡。8Gy TBI预处理的小鼠中位生存期为12.7天,15天内全部死亡。四组生存时间采用Log-rank检验,x~2=47.24,P＜0.0001。输注2.5×10~6骨髓细胞不能全部重建造血,100天生存率分别为62.5%,其余死于内脏出血。输注5×10~6骨髓细胞可全部重建造血,100天生存率为100%。单纯输注骨髓细胞不能诱发aGVHD。低剂量脾细胞输注小鼠aGVHD疾病程度轻未出现aGVHD相关死亡,中剂量脾细胞输注小鼠25%出现aGVHD相关死亡,高剂量脾细胞输注小鼠41天内100%死于aGVHD。单纯TBI处理组小鼠处理后14天内全部死于造血衰竭。同基因对照小鼠20天内全部死于白血病。异基因BMT组1/8只小鼠长期生存,7/8只小鼠于BMT后45天内死于白血病复发。四组生存时间采用Log-rank检验,x~2=40.22,P＜0.0001。+28d外周血细胞及脾细胞均达到完全供者嵌合体状态。结论:TBI 8Gy对于BALB/c小鼠是清髓性预处理。预处理后输注输注5×10~6个骨髓细胞可全部重建造血。输注5×10~6个脾细胞可诱发轻至中度aGVHD,不出现致死性aGVHD。移植前8天尾静脉接种1×10~6个EL9611白血病细胞可成功建立白血病微小残留病模型。三、供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对异基因造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响目的:探讨体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对异基因造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和淋系免疫重建的影响。方法:采用临床GVHD积分方法评价小鼠GVHD严重程度;定量PCR方法检测脾细胞sjTREC评价胸腺输出功能;RT-PCR方法检测T细胞受体β链谱型;流式细胞仪检测淋系重建;外周血涂片瑞氏染色检测白血病复发。在GVHD模型中40只小鼠随机分为4组。BMT对照组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个;GVHD对照组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个;NK细胞输注组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个+NK 1×10~7个;NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个+NK 1×10~7个,移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天。在EL9611白血病模型中BALB/c小鼠移植前.8d尾静脉接种1×10~6个EL9611细胞,70只小鼠分为6组,每组9-12只。TBI对照组:单纯TBI处理;同基因造血细胞移植对照组:输注BALB/c小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个;异基因造血细胞移植对照组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个;NK细胞输注组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个+NK 1×10~7个;NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组一:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个+NK1×10~7个,移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天;NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组二:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 5×10~6个+NK 1×10~7个,移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共14天。结果:骨髓移植对照组BALB/c小鼠不出现GVHD表现。GVHD对照组小鼠移植后7天时出现不同程度的GVHD表现,并出现GVHD相关体重减轻。NK细胞输注组小鼠也出现aGVHD表现,但临床GVHD评分比对照组评分低(P＜0.05)。NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组小鼠各观察时间点临床GVHD评分比对照组评分明显低(P＜0.01)。单纯异基因骨髓移植组小鼠的皮肤、肝脏和肠道未见明显的病理改变。GVHD组小鼠出现皮肤、肝脏和肠道可见明显的病理改变。NK细胞输注组小鼠GVHD靶器官病理改变较GVHD对照组轻。同基因造血细胞移植组小鼠20天内全部死于白血病,无长期生存小鼠。异基因造血细胞移植组小鼠中位生存28天,90%(9/10只)于移植后52天内死于白血病复发,10%(1/10只)小鼠长期生存。NK细胞输注组小鼠中44.4%(4/9只)死于白血病复发,55.6%(5/9只)小鼠长期生存,与异基因HCT组比较生存期明显延长(x~2=4.487,P=0.0342)。NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组一小鼠20%死于白血病复发,80%(8/10只)长期生存,与NK细胞输注组比较生存期延长(x~2=1.065,p=0.3022)。NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组二小鼠8.3%(1/12只)死于白血病复发,91.7%(11/12只)长期生存,与NK细胞输注组比较生存期延长(x~2=4.018,P=0.0450)。NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗组、NK细胞输注组和对照组小鼠移植后28天脾细胞计数分别为(4.78±0.51)×10~7、(3.98±0.43)×10~7、(3.45±0.23)×10~7,NK细胞输注及细胞因子治疗小鼠脾细胞总数明显高于对照组小鼠(P＜0.01)。而且NK细胞输注及细胞因子治疗组小鼠T细胞、B细胞、NK细胞均高于对照组小鼠(P＜0.01)。对照组移植小鼠sjTREC拷贝数为136.6±13.7/10~5,NK细胞输注组和NK细胞输注及细胞因子治疗组小鼠SjTREC拷贝数为222.2±11.4/10~7、287.5±10.9/10~5,均明显高于对照组(P＜0.01)。移植后一个月时NK细胞输注组脾脏TRBV重建明显比对照组TRBV重建快。结论:体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗可减轻异基因造血干细胞移植后GVHD严重程度,保护胸腺增强输出功能促进T细胞谱型重建,促进外周T细胞、B细胞、NK细胞等淋系重建,增强移植物抗白血病作用减少白血病复以。四、供者NK细IN输注及IL-2、IL-15治疗对单倍型相合造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响目的:建立B6→CB6F1单倍型相合造血细胞移植后非致死性aGVHD模型,探讨体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对单倍型相合造血细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响。方法:采用临床GVHD积分和病理组织学方法评价小鼠GVHD严重程度;实时定量PCR方法检测SjTREC拷贝数评价移植后胸腺输出功能;RT-PCR结合毛细管电泳检测T细胞受体β链谱型评价TRBV谱型;多参数流式细胞仪检测脾脏淋系重建;外周血涂片瑞氏染色检测白血病复发。在GVHD模型中40只小鼠随机分为4组,每组10只。骨髓移植对照组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个;GVHD对照组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 15×10~6个;NK细胞输注组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 15×10~6个+NK 1×10~7个;NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 15×10~6个+NK 1×10~7个,移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天。在EL9611白血病模型中CB6F1小鼠移植时尾静脉接种2×10~6个EL9611白血病细胞,每组10只。单倍型相合造血细胞移植对照组:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 10×10~6个;NK细胞输注组:输注B6小鼠来源BMCs5×10~6个+SCs 10×10~6个+NK 1×10~7个;NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组一:输注B6小鼠来源BMCs 5×10~6个+SCs 10×10~6个+NK 1×10~7个,移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天;NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组二:输注B6小鼠来源BMCs5×10~6个+SCs 10×10~6个+NK 1×10~7个,移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共14天。结果:11.5Gy X线TBI对于CB6F1小鼠为清髓性预处理。GVHD对照组小鼠移植后7天时出现GVHD表现。NK细胞输注组小鼠各时间点临床GVHD评分比对照组评分低(P＜0.05)。NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组小鼠各观察时间点临床GVHD评分比对照组评分明显低(P＜0.01)。GVHD对照组小鼠出现皮肤、肝脏和肠道可见明显的病理改变。NK细胞输注组小鼠GVHD靶器官病理改变较GVHD对照组轻。单倍型相合造血细胞移植对照组小鼠100天生存率为20%(2/10只),80%(8/10只)于移植后死于白血病复发。NK细胞输注组小鼠中10%(1/10只)死于白血病复发,90%(9/10只)小鼠长期生存。NK细胞输注IL-2I与L-15治疗组小鼠均长期生存,无死于白血病小鼠。四组生存时间采用Log-rank检验,x~2=30.69,P＜0.0001。NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗组、NK细胞输注组和对照组小鼠移植后28天脾细胞计数分别为(5.39±0.59)×10~7、(4.42±0.39)×10~7、(3.68±0.47)×10~7,NK细胞输注及细胞因子治疗小鼠脾细胞总数明显高于对照组小鼠(P＜0.01)。而且NK细胞输注及细胞因子治疗组小鼠T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞计数均高于对照组小鼠(P＜0.01)。对照组移植小鼠sjTREC拷贝数为155.3±10.7/10~5,NK细胞输注组和NK细胞输注及细胞因子治疗组小鼠sjTREC拷贝数为246.5±29.4/10~5、298.5±16.0/10~5,均明显高于对照组(P＜0.05)。移植后一个月时NK细胞输注组脾脏TRBV重建明显比对照组TRBV重建快。结论:体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗可减轻单倍型相合造血干细胞移植后aGVHD严重程度,保护胸腺增强输出功能促进T细胞谱型重建,促进外周T细胞、B细胞、NK细胞等淋系重建,增强移植物抗白血病作用减少白血病复发。