毛白杨(Populus tomentosa)谷甾醇糖基转移酶基因克隆及其基因编辑效应初探

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毛白杨(Populus tomentosa)属于杨柳科杨属白杨派,是我国重要的工业用材、城乡绿化和生态防护树种。纤维素对于木材加工、制浆造纸、纺织和化学工业等非常重要,在植物细胞中,纤维素合成是一个复杂的生化过程。谷甾醇糖基转移酶(SGT)其功能是与膜结合使特定受体谷甾醇糖基化产生谷甾醇-葡萄糖苷(SG),而纤维素分子合成过程中谷甾醇-葡萄糖苷作为引物,在纤维素合酶(CesA)的作用下,以UDP-葡萄糖(UDP-Glucose)为底物,以β-1,4-糖苷键的方式形成葡聚糖链。因此谷甾醇糖基转移酶(SGT)对于植物纤维的合成至关重要。本研究以毛白杨为试材,采用Real-Time PCR技术克隆了 SGT基因家族成员,进行系列生物信息学和基因表达模式分析;进一步利用基因编辑技术CRISPR/Cas9创造了突变体新材料,对其功能进行了研究。研究结果为深入解析毛白杨纤维素合成中SGT基因的功能奠定基础,提供探索林木遗传改良的新途径,对毛白杨的遗传改良具有重要的意义。主要研究结果如下:1.克隆得到毛白杨PtSGT基因家族中PtSGT1、PtSGT3和PtSGT4基因,保守结构域分析PtSGT基因可能与糖基转移和UDP-葡萄糖醛酸转移有关;荧光定量PCR结果显示,PtSGT基因家族的基因在茎中的表达量最高,推测相较于根和叶ptSGT基因在茎生长发育中的作用更加重要。2.利用CRISPR/Cas9技术构建了 8个单基因靶点载体与4个双基因靶点载体,通过农杆菌介导在毛白杨中进行了遗传转化,获得了 51个PCR检测结果呈阳性的植株,经测序分析获得PtSGT1与PtSGT4基因中靶点为8②和6的两个突变体株系8②-Ⅰ与6-B。3.糖代谢分析结果表明,在8②-Ⅰ突变体株系中,茎中的葡萄糖较野生型来说无显著差异,6-B突变体株系中,茎中的葡萄糖出现显著的增多。4.解剖结构分析显示,野生型WT的木质部细胞排列紧密整齐,细胞较小,突变体株系8②-Ⅰ、6-B的木质部薄壁细胞排列较为凌乱松散,细胞相比于野生型来说更大,野生型木质部薄壁细胞比突变体8②-Ⅰ、6-B的木质部薄壁细胞更厚;野生型WT髓中的薄壁细胞形状不规则排列凌乱,突变体株系8②-1、6-B髓中的薄壁细胞形状呈较为规则的多边形,排列方式也较为整齐。
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