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天牛是对林木危害最严重的蛀干害虫之一,由于天牛幼虫蛀食活立木木质部,在树干内形成虫孔严重影响树木生长和木材的利用价值,已经给我国的林业生产和生态环境造成严重损失。尽管对天牛的防治已开展了大量研究,但是由于天牛幼虫在树干内蛀食木材为害,受外界环境影响小,因而化学防治控制难度极大,天牛危害形势依然十分严峻。与传统的害虫防治方法相比,生物防治具有选择性强、使用安全的优点。苏云金芽孢杆菌是一种重要的杀虫微生物,它所携带的Bt毒蛋白基因在目前害虫防治的实践中占有极为重要的地位,而且转Bt基因作物已经在世界范围内广泛种植,用于害虫的防治。抗天牛基因工程无疑是解决天牛灾害问题的有效途径之一。本课题组成功分离出一种对鞘翅目昆虫具有很高杀虫活性的Bt886-Cry3Aa基因,其产物对光肩星天牛和桑天牛的抗虫活性达到60%以上。但将该Cry3Aa基因和用杨树偏好的密码子改良的Cry3Aa基因同时进行杨树的遗传转化后得到的转基因84K杨树由于Cry3Aa基因的表达量很低不能有效控制天牛。因此,需要进一步对Cry3Aa毒素进行改造来增强它的杀虫活性,才能达到有效控制天牛的目的。增强Cry毒素的毒性有两种途径:一是与毒蛋白一起联合使用其他抑制昆虫生长的蛋白,二是改造Cry3Aa基因。本课题组之前从天牛的消化生理入手,用噬菌体展示技术筛选出了能与天牛中肠内最主要的消化酶(纤维素酶)特异亲合的两个短肽P1(LPPNPTK)和P2(TPHRSPL)。本实验将纤维素酶亲合短肽与Cry3Aa融合,融合后的Cry3Aa蛋白可能会与天牛中肠的纤维素酶结合,以期通过两种可能的机制增强融合蛋白对天牛的毒性:一种是在中肠内的滞留时间延长,充分发挥毒蛋白的作用;另一种是抑制纤维素酶的活性,使天牛不能消化食物,最终生长发育受到抑制。设计引物时分别将编码P1和P2短肽的核苷酸序列添加到上下游引物的5’端,通过PCR扩增得到6种融合毒蛋白基因,其中4种融合毒蛋白基因只融合了1个短肽序列(P1/P2),2种融合毒蛋白基因同时融合了2个短肽序列(P1+P2)。通过一系列分子克隆操作分别构建了7个原核表达载体:p ET30a(+)-Cry3Aa、p ET-30a(+)-P1-Cry3Aa、p ET-30a(+)-P2-Cry3Aa、p ET-30a(+)-Cry3Aa-P1、p ET-30a(+)-Cry3Aa-P2、p ET-30a(+)-P1-Cry3Aa-P2、p ET-30a(+)-P2-Cry3Aa-P1。原核表达后分别得到了7种融合基因的表达产物,经SDS-PAGE分离总蛋白、Western Blot分析、ELISA检测以及液相串联质谱方法鉴定后确定表达产物中确实含有目的蛋白。大规模诱导、收集7种毒蛋白,以桑天牛一龄幼虫为试虫进行毒蛋白的生物活性测定。虫试结果显示:P1-Cry3Aa、Cry3Aa-P1和P1-Cry3Aa-P2等3种毒蛋白对桑天牛幼虫的杀虫活性与Cry3Aa毒蛋白相比显著提高,其中P1-Cry3Aa的校正死亡率几乎是Cry3Aa的3倍,P1-Cry3Aa-P2对桑天牛幼虫的生长抑制率达到了62.4%,超过了Cry3Aa的3倍。用P1和P2短肽融合Cry3Aa能获得杀虫活性提高的融合Cry3Aa毒蛋白,这为增强Cry蛋白的毒性提供了一种新策略。通过比较融合毒蛋白在桑天牛幼虫中肠内滞留的时间和对桑天牛中肠纤维素酶活性的影响,进一步分析了纤维素酶亲合短肽融合Cry3Aa蛋白对桑天牛杀虫活性提高的机理。收集喂食三种不同毒蛋白的桑天牛幼虫在不同时间的排泄物进行分析,发现Cry3Aa蛋白主要集中在4 h收集的排泄物中,而短肽融合Cry3Aa蛋白主要集中在6 h的排泄物中,说明短肽融合Cry3Aa蛋白在桑天牛幼虫中肠内滞留的时间长;同时分析了三种毒蛋白在桑天牛取食后4小时后中肠内的残留量,发现取食融合Cry3Aa蛋白的桑天牛幼虫中肠提取液中Cry3Aa的浓度显著高于取食Cry3Aa的中肠提取液。这一结果与相应时间段的排泄物中Cry3Aa的含量相一致,证实了短肽融合毒蛋白和中肠内的纤维素酶特异性的亲合延长了Cry3Aa毒蛋白在中肠内的时间,说明纤维素酶亲合短肽对Cry3Aa毒蛋白杀虫活性的提高与毒蛋白在中肠内滞留时间延长是相关联的。通过测定短肽融合蛋白与纤维素酶结合后纤维素酶的活性,结果显示短肽融合蛋白不能改变纤维素酶活性,说明纤维素酶亲合短肽对Cry3Aa毒蛋白杀虫活性的提高与纤维素酶活性无关,而与融合蛋白在中肠内滞留时间的延长有关。短肽Cry3Aa融合蛋白可以有效提高对桑天牛的抑制活性,将为天牛的防治提供了基础。目前杨树遗传转化工作正在进行,如果在树木中表现稳定的杀虫活性,将为树木抗虫育种做出贡献。