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1.前言创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)是一种特殊形式的焦虑障碍,是指个体在经历或目睹异乎寻常的、严重的威胁性或灾难性事件后所导致的延迟出现和持续存在的反应。有研究证实,下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamus-Pituitary-adrenal, HPA)轴的异常激活会导致神经递质功能紊乱和行为异常。因此,HPA轴的功能紊乱是PTSD发病机制的关键因子之一。多项研究结果表明,PTSD的发病涉及促肾上腺皮质激素释放因子(corticotrophin releasing factor, CRF)过度分泌或应激源诱导的CRH过度反应。作为激活和调节HPA轴功能的上游关键因子,CRF及其受体CRFR1 (corticotrophin releasing factor receptor 1)在焦虑、抑郁和PTSD等情感障碍的发病机制中扮演了重要角色。众多研究证实,个体对PTSD的易感性存在差异,而早年应激经历是导致PTSD易感性增加的重要因素之一。青少年时期是个体神经生物和行为发展的一个非常关键和特殊的时期,在这期间我们可以观察到边缘系统和前额叶皮质区域的特异性改变。在个体早年发育期间对CRF受体的表达及其功能进行调节可能是其相关神经元功能失调的重要原因,并且该影响可能会持续终生,这无疑会增加成年期罹患应激相关疾病的易感性。另外,表观遗传学研究发现,小鼠暴露于应激环境时,杏仁核miR-34c表达水平升高,焦虑样行为降低,进一步研究发现,miR-34c作用的靶点之一是CRFR1mRNA。但对早年应激经历与CRFR1和miR-34c以及PTSD易感性关系的研究非常有限。许多研究均证实,运动作为一种潜在的非药物治疗手段,对大脑功能以及神经元可塑性都大有裨益。本实验聚焦青少年期创伤应激对成年动物焦虑、抑郁行为、HPA轴功能、中枢CRFR1和miR-34c的影响,揭示CRFR1和miR-34c在早年经历致PTSD发病易感性中的作用,以及规律跑台运动对PTSD样症状的调节作用。2.研究目的(1)青少年早期创伤性应激对成年期焦虑与抑郁样行为、记忆、HPA轴功能及CRFR1表达的作用。(2)规律跑台运动与CRFR1拮抗剂对行为、HPA轴功能及CRFR1表达的调节作用。(3)青少年早期创伤性应激对行为学、CRFR1、CRFR1 mRNA和miR-34c表达的短期和长期作用；CRFR1拮抗剂对上述指标的改善作用。3.材料和方法(1)实验分组实验一：64只雄性21日龄Wistar大鼠随机分为4组：对照组(CON)、应激组(S)、应激加运动组(S+E)和应激加拮抗剂组(S+A),每组16只。除去对照组,其它三组均制备PTSD模型。实验二:72只雄性21日龄Wistar大鼠随机分为三组：对照组(CON)、应激组(S)和应激加拮抗剂组(S+A),每组24只。在PTSD造模完成两周后,每组随机抽取12只进行行为学和分子生物学实验,其余12只继续饲养至成年(造模完成六周后)后进行行为学和分子生物学实验。(2) PTSD模型制备将大鼠置于密闭不透光的电击箱中,大鼠足部收到持续6s,连续20次不可逃避的电流刺激,电流强度为8mA。电击时间间隔随机,每次持续30min。上下午各一次,间隔时间不少于4h,持续6天。(3) CRFR1拮抗剂CP-154,526的使用方法S+A组动物在PTSD模型建立后第二天腹腔注射CRFR1拮抗剂。将拮抗剂溶于80%的聚乙烯乙二醇400中,剂量为3.2mg/kg/day,持续14天。为平衡处理误差,其它组的动物腹腔注射80%的聚乙烯乙二醇400。(4)跑台运动训练程序实验一中的S+E组的动物在PTSD模型建立后第二天开始为期六周,每周五次的跑台运动。(5) DEX/CRH联合试验 实验一行为学实验结束之后,每组随机抽取8只大鼠接受DEX/CRH联合试验。(6)行为学测试实验一在造模完成六周后进行行为学测试,试验二分别在造模完成后两周和六周进行行为学测试。行为学测试包括旷场试验、高架十字迷宫试验,Y迷宫试验和Morris水迷宫测试。(7)免疫组化检测CRFR1表达实验一行为学测试结束以后,随机抽取大鼠处死,脑组织分离后用蜡块包埋。内侧前额叶、下丘脑、海马和杏仁核的组织切片方向为冠状,厚度为5微米,随后采用免疫组化染色方法检测CRFR1表达。(8)免疫印迹分析CRFR1表达取内侧前额叶、下丘脑、海马和杏仁核组织在冰上匀浆,匀浆液在低温离心机中以14000转的速度离心30分钟,取上清液。测得蛋白浓度后以一定的比率与上样缓冲液混合95℃加热变性。取总量20微克的蛋白于12%的凝胶中电泳,转膜至PVDF膜。牛奶封闭后,PVDF膜加一抗4℃过夜,第二天PBST漂洗后加二抗室温孵育一小时。PBST漂洗后加入ECL发光液显影,条带的灰度值使用ImageJ14.0软件计算。(9)实时定量PCR检测CRFR1mRNA和miR-34c取50-100mg的下丘脑组织,加入1毫升Trizol提取总RNA。取1m1RNA采用实时定量PCR的方法用来检测CRFRlmRNA和miR-34c。其相对表达量用以下公式计算,2(?)-[(Ct of CRFR1mRNA)-(Ct of GAPDH)]以及2(?)-[(Ct of miR-34c)-(Ct of U6)].4.结果(1)青少年早期创伤性应激导致大鼠成年期出现焦虑和抑郁样行为、记忆功能损害、HPA轴功能失调和CRFR1表达异常。(2)长期规律的跑台运动和CRFR1拮抗剂CP-154,526的长期应用可明显改善大鼠中枢CRFR1的表达。与CRFR1拮抗剂相比,跑台运动对减轻大鼠成年期的焦虑和抑郁样行为,改善其记忆功能,稳定HPA轴功能的效果更好。(3)青少年早期创伤性应激在两周内导致大鼠焦虑样行为增加和记忆功能损伤,同时下丘脑miR-34c表达上调,CRFR1表达降低。(4)青少年早期创伤性应激导致大鼠成年后的焦虑样行为增加和记忆功能损伤,CRFR1表达升高,但下丘脑miR-34c表达与对照组相比无明显差异。(5) CRFR1拮抗剂CP-154,526明显升高青少年期和成年期下丘脑miR-34c表达水平。5.结论(1)青少年早期创伤性应激导致大鼠持续至成年的情绪、记忆、HPA功能以及中枢CRFR1表达异常。(2)中枢CRFR1表达异常和下丘脑miR-34c表达异常在早年应激经历致成年期PTSD发病易感性中发挥重要的作用。(3)长期规律运动和CRFR1拮抗剂可明显改善青少年期PTSD症状、改善HPA轴的功能和中枢CRFR1表达。(4) CRFR1拮抗剂可明显升高青少年期和成年期下丘脑miR-34c表达。提示长期规律运动和CRFR1拮抗剂的作用靶点是CRFR1和miR-34c。