膀胱癌是世界第七大常见的恶性肿瘤,是中国泌尿系肿瘤最常见的致死原因。浸润性膀胱癌侵袭性强,进展迅速,患者死亡率高。肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）,通过自我增殖产生异质性的肿瘤细胞群,促进肿瘤的生长、侵犯、转移、治疗抵抗和复发。对肿瘤进展至关重要的第二个因素是上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）,即失去上皮标记物E-cadherin,同时获得间质标记物N-cadherin,Fironectin和Vimentin表达。肿瘤相关的EMT是复杂的过程,分化的上皮肿瘤细胞通过代谢和表观遗传学改变去分化为未分化状态,不仅表达干细胞标记,而且获得干细胞功能。鉴于EMT和CSC在肿瘤进展中的重要作用,研究EMT和CSC基因学和表观遗传学调控机制有利于精准有效的肿瘤治疗。表观遗传学特别是HDACs调节EMT和CSC。能量代谢的重排是肿瘤的第七标记,肿瘤细胞最具特征的表型是Warburg效应,即肿瘤细胞即使在氧丰富情况下通过糖酵解而不是氧化磷酸化获得能量。LDH-A,作为将丙酮酸转化为乳酸的酶,在Warburg效应中起着重要作用。最近的研究表明表观遗传学修饰需要由细胞代谢产生的中间产物作为底物和辅酶因子。肿瘤细胞通过维持低水平的丙酮酸而阻止HDAC1/HDAC3的抑制,从而避免死亡。那么,将丙酮酸转化为乳酸的LDH-A是否通过活化HDACs调节EMT和CSC从而促进恶性肿瘤的进展?本研究中,我们通过对浸润性膀胱癌临床组织标本和细胞株进行相关研究,旨在阐明浸润性膀胱癌分子调控机制,为改善其预后提供潜在的作用靶点。第一部分LDH-A表达与浸润性膀胱癌预后相关性研究目的:研究LDH-A在浸润性膀胱癌组织和膀胱癌细胞株中的表达情况;LDH-A表达与临床病理参数、Oct4与E-cadherin表达的相关性;生存分析进一步研究LDH-A的表达与浸润性膀胱癌预后的相关性。方法:采用Westernblot方法检测永生化人膀胱黏膜上皮细胞株SV-HUC-1和膀胱癌细胞株SW780,BIU87,5637,T24,UMUC-3中LDH-A的表达。对136例临床资料完整和5年随访资料的浸润性膀胱癌及其对应癌旁正常膀胱组织标本采用免疫组化方法检测LDH-A在组织学水平的表达,结合临床病理资料对实验结果进行统计分析,并对136例患者进行生存分析。终末随访时间2015年3月。结果:1.Westernblot结果显示:和SV-HUC-1相比,LDH-A在浸润性膀胱癌细胞株T24和UMUC-3,以及高危浅表型膀胱癌细胞株5637表达明显上调,LDH-A在浸润性膀胱癌的高表达率明显高于癌旁正常组织（P<0.001）。2.在浸润膀胱癌组织中,LDH-A高表达与浸润深度（P=0.001）和区域淋巴结转移（P=0.009）显著相关。我们还发现LDH-A高表达与Oct4表达正相关（P=0.016）,与E-cadherin表达负相关（P=0.031）.而与其他临床病理参数如年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无明显相关。3.单因素分析显示:分析结果显示LDH-A高表达患者5年总生存和疾病相关生存均较LDH-A低表达患者降低（P<0.001,log-rank检验）。4.多因素分析显示:多变量Cox回归模型分析结果显示LDH-A高表达是总生存（P=0.003）和疾病相关生存（P=0.007）独立的预后因素。结论:LDH-A在浸润性膀胱癌中表达上调,LDH-A高表达患者总生存和疾病相关生存不良。LDH-A高表达与Oct4阳性表达呈正相关,而与E-cadherin表达负相关。提示LDH-A在浸润性膀胱癌中可能通过促进干性基因Oct4表达和活化EMT导致不良预后。需要”knock in and knock down”实验加以进一步验证。第二部分LDH-A通过活化EMT和上调干性基因表达促进浸润性膀胱癌肿瘤进展目的:构建LDH-A干扰序列si RNA1,si RNA2,si RNA3,瞬时转染浸润性膀胱癌细胞株UMUC-3,筛选出干扰效果最佳的序列（knock down）;质粒转染UMUC-3（knock in）。在RNA水平上检测LDH-A knock in和knock down后EMT标记物和包括Yamanaka因子在内的干性基因的表达变化;将变化显著的基因通过Westernblot在蛋白水平进行进一步验证。方法:1.采用Real-time RT-PCR和Westernblot方法检测质粒转染后LDH-A表达,并在三个LDH-A干扰序列筛选出对LDH-A干扰效果最佳者。2.筛选出来的干扰序列和质粒分别瞬时转染UMUC-3细胞,72小时提取RNA,Real-time RT-PCR方法检测EMT标记物和包括Yamanaka因子在内的干性基因的表达变化。3.对于有明显变化的基因用Wsternblot方法检测其蛋白水平的表达情况。4.干扰序列和质粒分别瞬时转染UMUC-3细胞后,用CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测凋亡;侵袭和转移实验检测侵袭和转移能力的变化。结果:1.Westernblot和Real-time RT-PCR结果证实质粒转染后LDH-A显著上调,si RNA3（KD）干扰效果最佳。2.si RNA3瞬时转染UMUC-3细胞,Real-time RT-PCR结果显示LDH-A敲除显著下调干性基因（Oct4,Sox2,Naong,c-myc,Bami1）（P<0.001）和间质标记物（Snail,N-cadherin,Fibronectin,Vimentin）以及HDAC2（P<0.001）,而E-cadherin明显上调（P<0.001）,HDAC1表达无明显改变（P>0.05）。Westernblot结果证实在蛋白水平Snail,Fibronectin,Oct4的下调和E-cadherin的上调。3.质粒瞬时转染UMUC-3细胞,Real-time RT-PCR结果显示LDH-A过表达显著上调干性基因（Oct4,Sox2,Naong,c-myc,Bami1）（P<0.001）和间质标记物（Snail,N-cadherin,Fibronectin,Vimentin）以及HDAC1,HDAC2（P<0.001）,而E-cadherin明显下调（P<0.001）。Westernblot结果证实在蛋白水平Snail,Fibronectin,Oct4的上调和E-cadherin的下调。4.LDH-A敲除明显降低UMUC-3细胞的增殖能力,并显著增加细胞的凋亡,降低侵袭和迁徙能力;LDH-A过表达明显增加UMUC-3细胞的增殖能力,并显著降低细胞的凋亡,促进侵袭和迁徙能力。结论:LDH-A通过上调EMT/CSC促进浸润性膀胱癌肿瘤进展,为改善浸润性膀胱癌预后提供潜在的治疗靶点。