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目的通过构建pEGFP-pre-miR-30a重组质粒并转染慢性粒细胞白血病K562细胞株,初步探讨miR-30a的高表达对K562细胞的促凋亡作用及作用机制,为寻找慢性粒细胞白血病(CML)潜在的治疗靶点提供新的思路及策略。方法1、化学合成miR-30a的前体序列pre-miR-30a,构建pEGFP-pre-miR-30a重组质粒并转染K562细胞,通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测其miR-30a的表达水平,以明确转染是否成功。2、以K562细胞为空白对照组,空载体pEGFP-C1质粒转染组为阴性对照组,pEGFP-pre-miR-30a重组质粒转染组作为实验组。采用实时定量PCR分别检测3组K562细胞的bcr/abl mRNA表达水平,凋亡试剂盒annexinV-FITC/PI及流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析K562细胞凋亡百分率,蛋白印迹法(Western blot)检测BCR/ABL融合蛋白、凋亡相关蛋白BCL-2、BAX含量。3、采用Western blot分别检测各转染组K562细胞的抑癌蛋白PTEN及信号通路蛋白AKT、p-AKT的表达水平。结果1、经酶切和测序结果证实,pEGFP-pre-miR-30a重组质粒构建成功。2、与K562空白对照组和pEGFP-C1-K562阴性对照组比较,重组质粒pEGFP-pre-miR-30a转染组K562细胞的miR-30a表达水平显著升高,表明转染成功。3、与K562空白对照组和pEGFP-C1-K562阴性对照组比较,重组质粒pEGFP-pre-miR-30a转染组bcr/abl mRNA与BCR/ABL融合蛋白表达明显下调,凋亡细胞所占比重明显增加,抗凋亡蛋白BCL-2水平降低,促凋亡蛋白BAX表达上升,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。4、与K562空白对照组和pEGFP-C1-K562阴性对照组相比,重组质粒pEGFP-pre-miR-30a转染组K562细胞的抑癌蛋白PTEN表达明显上升,AKT无明显变化,但其活性形式的表达量p-AKT显著降低,其差异均有统计学意义(p<0.05)。结论1、酶切和测序结果表明,pEGFP-pre-miR-30a重组质粒构建成功2、高表达的miR-30a能明显抑制K562细胞致癌基因bcr/abl及其蛋白BCR/ABL的表达水平,并可通过下调抗凋亡蛋白BCL-2、上调促凋亡蛋白BAX促进K562细胞凋亡。3、高表达的miR-30a可通过抑制BCR/ABL---PTEN/AKT信号通路的活性来诱导K562细胞凋亡。