氨氧化古细菌的富集培养及其对处理因子的响应

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氨氧化作用作为硝化过程的第一步,是氮素生物地球化学循环的关键步骤,氨氧化细菌中的变形菌纲β和γ亚群一直被认为是氨氧化作用的主要承担者。然而,近年来在环境基因组学研究上的突破以及泉古菌纯培养株系的获得,揭示了氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)广泛存在于各种生态系统中,是自然界中最丰富的氨氧化生物,在氮素生物地球化学循环中起着非常重要的作用。但是到目前为止,国内外相关研究者只获得了两株AOA纯菌,由于对其生理特性非常缺乏了解,因此难以对其生理机制作深入研究,所以AOA的富集及纯化培养已成为环境微生物生态学的研究热点。本研究对来自养殖水体AOA进行富集培养,研究不同氨氮浓度条件下AOA的数量变化,并分析其在不同化学因子条件下的生长情况以及多样性变化,同时,根据AOA菌体较小的特点,探索了微孔滤膜在AOA富集培养中的作用,掌握适于养殖水体AOA生态类型的富集培养条件。主要结果如下:  1.最适氨氮浓度实验结果表明,在培养基初始氨氮浓度分别为0.3 mM、3mM和30mM的各组实验中,AOA生长经历一个长时间的生长停滞期后才恢复生长,经过60天的富集培养,在3mM初始氨氮浓度实验组中检测到最高amoA拷贝数,说明3mM氨氮浓度最适于混合菌液中的AOA生态类群生长。  2.在微孔滤膜对AOA富集作用的实验中,荧光定量结果表明,0.45μm微孔滤膜可以将富集液中的杂菌降低高达3个数量级,而AOA数量没有数量级的变化。DGGE检测结果显示,过滤前后AOA群落多样性没有发生明显变化,而杂菌则因过滤致使其数量大幅降低,说明在AOA富集培养中0.45μm微孔滤膜可以有效提高富集液中AOA的富集纯度。  3.AOA对化学因子响应实验结果表明,同时添加AOA生长促进物质以及杂菌抑制物质实验组经过36d富集培养,AOA浓度高达6.76×109 copies/mL,富集液经0.45μm微孔滤膜过滤后,AOA百分比含量为82.89%,获得了高纯度的AOA富集液。  综上所述,本研究提出一种适合养殖水体AOA的富集培养模式:在3mM初始氨氮浓度条件下,添加AOA生长促进物质(丙酮酸钠和硫代硫酸钠),和杂菌抑制物质(链霉素、烯丙基硫脲和氯酸钠),利用长时间的富集培养(>36 d),最后通过0.45μm微孔滤膜过滤富集液可以得到高百分比含量的养殖水体AOA生态类群富集液。
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