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大熊猫作为我国特有濒危珍稀动物有活化石和国宝之称,目前已被列入国家一级重点保护动物。大熊猫西氏贝蛔虫病是由西氏贝蛔虫寄生于大熊猫小肠等器官所引起的一种寄生虫疾病。西氏贝蛔虫是圈养大熊猫体内的一种常见寄生虫,可引起宿主出现停食、呕吐、腹泻、消瘦、咳嗽、贫血、精神萎靡迟钝等症状,虫体还可造成大熊猫胃肠道、胆管及胰管堵塞等,严重时甚至引起死亡。目前对该病的诊断主要依靠饱和硫酸镁漂浮法及PCR检测法,但这两种方法均不能对该疾病进行早期诊断。本研究扩增并原核表达了西氏贝蛔虫硫氧还蛋白过氧化物酶和三磷酸甘油醛脱氢酶,并对其蛋白在虫体上的分布进行了定位。同时,利用间接ELISA方法评价了硫氧还蛋白过氧化物酶和三磷酸甘油醛脱氢酶的诊断价值,为大熊猫西氏贝蛔虫病的早期诊断和综合防控奠定了基础。一、西氏贝蛔虫三磷酸甘油醛脱氢酶的特征分析与重组抗原诊断价值的评估3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH或G3PDH)是寄生虫新陈代谢过程中的一个多功能酶,也是糖酵解途径中的关键酶。有研究表明,GAPDH可作为寄生虫病诊断的候选抗原。本研究从西氏贝蛔虫的总RNA中扩增出GAPDH蛋白基因,其全长ORF框含有1083bp,共编码360个氨基酸,蛋白分子质量约40KDa,西氏贝蛔虫GAPDH与猪蛔虫GAPDH的序列相似性为98%,原核表达重组GAPDH蛋白的分子量约为57KDa。免疫印迹显示:重组蛋白能被大熊猫西氏贝蛔虫病阳性血清识别,且为单一条带。荧光免疫组化显示:Bs-GAPDH广泛分布于整个虫体,包括肠道、卵巢、肌肉、虫卵、子宫和角皮,尤其是在肠道和虫卵中的GAPDH蛋白含量丰富。以该重组蛋白为抗原建立大熊猫西氏贝蛔虫病间接ELISA诊断方法,结果显示其敏感性为95.83%,特异性为100%,提示该蛋白可以作为大熊猫蛔虫病诊断候选抗原。二、西氏贝蛔虫硫氧还蛋白过氧化物酶的特征分析与重组抗原诊断价值的评估寄生虫作为一种需氧生物,面对的不仅是自身代谢所产生的内源性活性氧分子(ROS),还要抵抗来自于宿主免疫所产生的ROS,为了适应这种双重高氧化的胁迫压力,寄生虫需要通过一系列抗氧化系统来抵御ROS的氧化损伤作用,硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)就是其中一种极为重要的抗氧化酶。该蛋白广泛分布于各类真核生物和原核生物中,对机体具有重要的保护作用。本研究从西氏贝蛔虫的总RNA中扩增出Tpx蛋白基因,其全长ORF框含有588bp,共编码195个氨基酸,蛋白分子质量约22KDa,西氏贝蛔虫TPx与猪蛔虫TPx的序列相似性为95.38%,原核表达重组Tpx蛋白的分子量约为39KDa。免疫印迹显示:重组蛋白能被大熊猫西氏贝蛔虫病阳性血清识别,且为单一条带。荧光免疫组化结果为:Bs-Tpx广泛分布于整个虫体,包括肠道、卵巢、肌肉、卵、子宫和角皮,尤其虫体体壁、卵巢壁和虫卵的Tpx蛋白含量丰富。以该重组蛋白为抗原建立大熊猫西氏贝蛔虫病间接ELISA诊断方法,结果显示其敏感性为75%,特异性为91.7%,提示Bs-Tpx不适合作为大熊猫蛔虫病的诊断候选抗原。