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目的:糖尿病周围神经病(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病的慢性并发症,雪旺氏细胞是外周神经的主要支持细胞。雪旺氏细胞在糖尿病周围神经病中自噬抑制,确切的机制仍未完全阐明。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是催化组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基中除去乙酰基官能团的酶,可调节细胞的自噬功能。为探究HDAC是否参与糖尿病雪旺氏细胞的自噬抑制。本研究采用糖尿病小鼠和体外培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96(rat Schwann cell line),探究HDAC对雪旺氏细胞自噬的影响。方法:1.免疫组化、Luxol固蓝染色和电镜检测糖尿病小鼠坐骨神经结构及自噬相关蛋白的表达雄性CD1小鼠随机分为正常对照组(Control组)和糖尿病组(diabetic mellitus,DM组)。糖尿病模型小鼠采用腹腔单次注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)进行构建。喂养8周后处死小鼠,留取坐骨神经。免疫组织化学检测坐骨神经LC3和P62的表达,Luxol固蓝染色和电镜检测坐骨神经结构改变。2.Western blot和免疫荧光检测高糖对RSC96细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和P62表达的影响RSC96细胞在37℃,5%CO2培养箱内用含10%的胎牛血清及1%青链霉素混合液的DMEM培养基培养。RSC96细胞被随机分为正常糖组(normal glucose,N)、甘露醇组(D-Mannitoll,M)和高糖组(high glucose,H),分别刺激24 h、48 h和72 h后收集细胞,Western blot检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达,免疫荧光检测P62表达。3.Western blot、免疫荧光和转录组测序检测HDAC对高糖培养RSC96细胞自噬的影响(1)检测HDAC抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)对RSC96细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达的影响。细胞随机分为:正常糖组(normal glucose,N),正常糖+DMSO组(normal glucose+DMSO,N+DMSO),正常糖+TSA(normal glucose,N+TSA),高糖组(high glucose,H),高糖+DMSO组(high glucose+DMSO,H+DMSO),高糖+TSA组(high glucose+TSA,H+TSA)。终止培养后Western blot检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达,免疫荧光检测P62表达。(2)检测高糖对RSC96细胞HDAC家族m RNA表达的影响:RSC96细胞被随机分为正常糖组(normal glucose,N)和高糖组(high glucose,H),培养72 h后提取RNA进行转录组测序。检测高糖对RSC96细胞HDACs蛋白表达的影响:将细胞随机分为正常糖组(normal glucose,N)、甘露醇组(D-Mannitoll,M)和高糖组(high glucose,H),分别刺激24 h、48 h和72 h后收集细胞,Western blot和免疫荧光检测HDAC1、HDAC5和HDAC8蛋白表达。(3)检测下调HDAC1或HDAC5对RSC96细胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的直接影响。使用Lipofectamine3000转染试剂将p Genesil-1-HDAC1、p Genesil-1-HDAC5和p Genesil-1-NC(negative control)分别转染进RSC96细胞,高糖刺激48 h。Western blot检测HDAC1、HDAC5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达。4.Western blot、免疫荧光和转录组测序检测HDAC1对高糖培养RSC96细胞Atg3、Atg5和Atg7的表达及自噬的影响(1)检测高糖处理对RSC96细胞Atg3、Atg5和Atg7表达的影响。RSC96细胞随机分为正常糖组(normal glucose,N)和高糖组(high glucose,H),培养72 h后提取RNA进行转录组测序。RSC96细胞被随机分为正常糖组、高糖组和甘露醇组,72 h后收集细胞,Western blot和免疫荧光检测Atg3、Atg5和Atg7蛋白表达。(2)检测下调HDAC1对RSC96细胞Atg3、Atg5和Atg7的直接影响。RSC96细胞随机分为p Genesil-1-NC组和p Genesil-1-HDAC1组,转染后分别给予正常糖和高糖刺激48 h。Western blot检测Atg3、Atg5和Atg7蛋白表达。(3)检测下调Atg3对HDAC1敲低改善的高糖培养RSC96细胞自噬功能的影响。RSC96细胞随机分p Genesil-1-HDAC1组和p Genesil-1-HDAC1+p Genesil-1-Atg3组,高糖培养48 h后Western blot检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、cleaved caspase-3和total caspase-3蛋白表达。结果:1.糖尿病小鼠坐骨神经中LC3和P62的蛋白表达及结构异常免疫组织化学检测结果表明糖尿病组与正常对照组相比,糖尿病组坐骨神经中LC3和P62减少,Luxol固蓝染色显示糖尿病组有髓鞘神经纤维萎缩,电镜观察糖尿病组髓鞘结构异常出现分层和内折。2.高糖对RSC96细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达的影响Western blot结果显示:高糖组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值在24 h,高糖组是正常糖组的1.73倍(P<0.05),高糖组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值在48 h和72h与正常糖组相比分别下降54.65%和80.58%(P<0.05),高糖组P62蛋白表达在24 h、48 h和72 h均与正常糖培养的RSC96相比分别降低32.67%、58.09%和48.08%(P<0.05)。免疫荧光结果显示,P62主要定位于RSC96细胞的胞浆,高糖组P62荧光强度明显低于正常糖组。3.HDAC对高糖培养RSC96细胞自噬的影响(1)HDAC抑制剂TSA对RSC96细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达的影响。正常糖培养的RSC96细胞给予HDAC抑制剂TSA处理,Western blot结果显示:与N+DMSO组比较,N+TSA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高了1.74倍(P<0.05),两组间P62蛋白表达量未见显著差异。高糖培养的RSC96细胞给予HDAC抑制剂TSA处理,Western blot结果显示:与H+DMSO组比较,H+TSA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高了1.60倍(P<0.05),两组间P62蛋白表达量未见显著差异。免疫荧光结果显示:RSC96细胞中H+TSA组与H+DMSO组比较,P62荧光强度未见显著差异。(2)高糖处理对RSC96细胞HDAC家族成员m RNA和蛋白表达的影响。转录组测序结果显示:高糖组HDAC1、HDAC5和HDAC8 m RNA是正常糖组的3.47倍、2.94倍和2.93倍。Western blot结果显示:高糖组与正常糖组相比HDAC1蛋白表达量在24 h、48 h和72 h分别增加2.15倍、1.79倍和3.48倍(P<0.05),高糖组与正常糖组相比HDAC5蛋白表达量在24 h、48 h和72 h分别增加1.58倍、1.74倍和3.00倍(P<0.05),HDAC8蛋白表达量未见显著差异。免疫荧光结果显示:HDAC1主要定位于RSC96细胞胞核,高糖组HDAC1荧光强度高于正常糖组。HDAC5主要定位于RSC96细胞胞核和胞浆,高糖组HDAC5荧光强度高于正常糖组。(3)下调HDAC1或HDAC5对RSC96细胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的直接影响。采用靶向敲低HDAC1的sh RNA转染高糖培养的RSC96细胞,Western blot结果显示p Genesil-1-HDAC1组与p Genesil-1-NC组相比LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加了2.64倍(P<0.05)。采用靶向敲低HDAC5的sh RNA转染高糖培养的RSC96细胞,与对照组相比LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值未见显著差异。4.HDAC1对高糖培养RSC96细胞Atg3、Atg5和Atg7的表达及自噬的影响(1)高糖处理对RSC96细胞Atg3、Atg5和Atg7表达的影响。转录组测序结果显示:RSC96细胞高糖组与正常糖组相比Atg3和Atg5分别降低了30.6%和67.4%,Atg7增加了1.33倍。Western blot结果显示:RSC96细胞高糖组与正常糖组相比Atg3蛋白表达减少26.70%(P<0.05),Atg7蛋白表达增加1.72倍(P<0.05),Atg5蛋白表达量未见显著差异。免疫荧光结果显示:Atg3、Atg5和Atg7主要定位于RSC96细胞胞浆,与正常糖组比,高糖组Atg3荧光强度明显降低,Atg7荧光强度明显升高,Atg5荧光强度未见显著差异。(2)下调HDAC1对RSC96细胞Atg3、Atg5和Atg7的直接影响。Western blot结果显示:正常糖培养的RSC96细胞,p Genesil-1-HDAC1组与对照组相比Atg3蛋白表达升高了1.33倍(P<0.05),而Atg5和Atg7蛋白表达量未见显著差异。在高糖培养的RSC96细胞,HDAC1敲低组与对照组相比Atg3蛋白表达升高了1.31倍(P<0.05),而Atg5和Atg7蛋白表达量也未见显著差异。(3)下调Atg3对HDAC1敲低改善的高糖培养RSC96细胞自噬功能的影响。Western blot结果显示:p Genesil-1-HDAC1+p Genesil-1-Atg3组与单独转染p Genesil-1-HDAC1组相比,Atg3蛋白表达降低了43.94%(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低了22.93%(P<0.05),cleaved caspase-3/total caspase-3比率增加1.91倍(P<0.05)。结论:1.糖尿病小鼠坐骨神经自噬相关蛋白表达下降。2.高糖诱导的RSC96细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和P62表达降低,自噬功能减弱。3.高糖诱导的RSC96细胞HDAC1表达上调,介导了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的下降。4.高糖诱导的RSC96细胞Atg3表达减少,介导了HDAC1对LC3-Ⅱ转化及自噬的影响。