类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以侵袭性、慢性、进行性、致残性关节病变为主要表现的全身性自身免疫病[1]。若不及时治疗,病情会迅速发展,导致关节软骨损伤加剧,最终造成关节畸形、功能丧失,具有极高的致残率。因此,系统地阐明参与RA关节邻近骨、软骨损伤的相关信号通路,发现其中的关键分子及调控机制,既能为RA的发生、发展提出新的理论认识,还能为RA的临床治疗提供潜在的药物作用靶点。现有的研究表明:RA的基本病理特征是周身关节滑膜炎症的累积以及血管翳形成。血管翳中的免疫病理成分可分为免疫和侵蚀两部分[2]。其中侵蚀部分主要由邻近骨、软骨的破骨细胞(Osteoclast)和滑膜成纤维细胞(Synovial Fibroblast,SF)构成,滑膜成纤维细胞包括巨噬细胞样滑膜细胞和成纤维细胞样滑膜细胞(Fibroblast-Like Synovial Cells,FLS)。FLS过度分泌的基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMPs)被认为是RA骨、软骨破坏的“罪魁祸首”。RA组织中的MMPs直接参与了对关节骨、软骨的降解,产生的Ⅱ型胶原(CollageⅡ)又能诱导FLS分泌MMPs,进而形成恶性循环,加剧关节骨、软骨的破坏。我们前期发现:①盘状结构域受体2(DDR2)在RA患者滑膜组织及FLS细胞中高表达,并呈持续活化状态[3,4];②原代培养的RA患者FLS细胞能够持续高水平分泌MMP1、MMP13等与RA关节邻近骨、软骨病理损伤直接相关的MMPs分子[5];③DDR2可通过调节AP1、Runx2的转录活性调控MMP1、MMP13等MMPs分子的表达[5];④通过对DDR2受体胞外区的研究,我们发现DDR2胞外区可以阻断Ⅱ型胶原与DDR2的结合并可抑制RA滑膜细胞分泌MMP-1[6];此外,我们还在针对(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠关节炎模型的研究中发现,可溶性的DDR2可改善RA关节邻近骨、软骨的损伤[7]。尽管前期我们以DDR2在RA发生、发展进程中的功能研究为切入点,进行了一些研究并取得了一些成果,但是仍有许多问题值得深入探讨:1.DDR2是分布在FLS细胞膜表面的具有酪氨酸蛋白激酶活性的受体,Ⅱ型胶原使DDR2发生磷酸化激活之后,它会结合哪些分子?2.这些分子是磷酸化分子还是非磷酸化分子?3.它们的功能又是什么?能够调控MMPs的表达吗?对于上述问题的回答有利于阐明DDR2介导RA FLS细胞MMPS过分泌的分子机制,并系统揭示Ⅱ型胶原作用下的RA关节邻近骨、软骨损伤的机制。因此,我们在前期工作的基础之上,拟从以下三个方面展开研究:①利用DDR2过表达慢病毒上调FLS细胞中DDR2的表达水平,以DDR2的相互作用分子为突破口,利用免疫沉淀结合SDS-PAGE的方法获得DDR2的相互作用分子,并利用多肽质谱确定其身份。结合生物信息学分析和相关文献的研究结果,我们以筛选得到的DDR2相互作用分子--波形蛋白(Vimentin)为研究对象,利用免疫共沉淀确定DDR2与Vimentin的相互作用关系,利用激光共聚焦显微镜观察Vimentin与DDR2在FLS细胞中的表达及分布情况。②利用RNAi、Real-time PCR、Western Blot等实验手段,考察DDR2活化后对Vimentin的表达及磷酸化状态的影响。并以Vimentin的功能研究为切入点,考察Vimentin对MMPs及FLS细胞侵袭、迁移能力的影响。③最后,我们以骨性关节炎(OA)患者的滑膜组织为阴性对照,扩大样本数,系统考察Vimentin在RA患者滑膜组织中的表达、分布情况,进一步评价其临床意义。通过上述实验的开展,我们得到以下结果:①通过免疫沉淀结合SDS-PAGE分离的方法,得到了8个DDR2相互作用蛋白,经多肽质谱和生物信息学分析,确定了8个蛋白的身份,我们选择Vimentin作为下一步的研究对象;②在HEK293T细胞中,通过免疫共沉淀的手段,确认了活化的DDR2与Vimentin的相互作用关系;③利用激光共聚焦显微镜观察发现DDR2与Vimentin在RA FLS细胞中存在共定位关系;④用Ⅱ型胶原活化RA FLS细胞膜上的DDR2后,Vimentin的表达水平变化不大,但Vimentin的磷酸化水平显著升高;⑤Vimentin的磷酸化激活可以促进RA FLS中MMP13的表达;⑥Transwell侵袭实验和细胞划痕实验结果显示,Vimentin的磷酸化激活能够促进RA FLS细胞的侵袭、迁移;⑦在扩大样本量后,以OA患者滑膜组织为对照,RA患者滑膜组织中Vimentin的表达水平与磷酸化水平均高于OA滑膜组织。通过本研究,我们首次证实了Vimentin与活性型DDR2的相互作用关系,并且作为DDR2的相互作用分子,Vimentin在介导RA FLS细胞MMPs过分泌及促进RA FLS细胞侵袭、迁移和关节软骨破坏过程中扮演了重要角色。上述研究结果补充和完善了我们课题组提出的Ⅱ型胶原-DDR2-MMPs通路在介导RA关节软骨侵袭、破坏机制中的关键分子和重要环节,既为阐明RA中晚期病变的发病机制提供了新的思路,又为开发治疗或缓解RA关节邻近骨、软骨损伤的新药提供了潜在的靶点。