焦虑症(anxiety disorder)是常见的精神类疾病。表现为没有事实根据也无明确客观对象和具体观念内容的提心吊胆和恐惧不安的心情,还有植物神经症状和肌肉紧张,以及运动性不安。焦虑症分为惊恐障碍和广泛性焦虑两种形式。在我国,焦虑症已成为现代社会的常见病和多发病,影响着人们的生活质量。焦虑症与情绪调节、身心健康密切相关,早期的中医理论即蕴含着情绪调节的原始思想。心、肝两脏功能的的正常与否对精神情志活动有重要的影响,以及心、肝气血阴阳平衡对维持精神情志活动具有重要的意义,认为心、肝两脏的功能主宰和影响着人的精神情志活动。中药中多种药物对情志具有调节作用,也引起研发人员的关注。合欢花为豆科植物合欢Albizzia julibrissin Durazz的干燥花序或花蕾,性甘味平,归心、肝经,具有解郁安神之功效,常用于治疗心神不安,忧郁失眠。查阅文献显示,合欢花相关的药理学报道多为镇静、催眠和抗抑郁作用,对其抗焦虑作用的药理学研究尚属空白。且对合欢花的研究存在系统性不强、药效部位不明确的诸多问题。因此有必要对合欢花的抗焦虑活性部位进行系统研究,阐明其抗焦虑的药效物质基础,为其后续研究奠定基础。本课题对合欢花的抗焦虑物质进行探究,分别用药理模型评价合欢花水提液、合欢花70%乙醇提取液、合欢花总黄酮和槲皮苷的抗焦虑作用；为明确合欢花的药效部位,分别对合欢花总黄酮的纯化和含量测定方法进行探讨：通过药理模型评价合欢花总黄酮中主要物质槲皮苷的抗焦虑作用,并探讨其抗焦虑机制。明确合欢花的抗焦虑物质基础,同时探究其可能的抗焦虑机制。本课题采用高架十字迷宫实验和明暗箱实验,对合欢花水提液和70%乙醇提取液的抗焦虑作用进行考察,明确70%乙醇提取液具有抗焦虑作用；探究运用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定合欢花总黄酮含量,明确有效部位含量；采用大孔树脂纯化合欢花总黄酮,提高有效部位纯度；采用高架十字迷宫实验和明暗箱实验,对合欢花总黄酮的抗焦虑作用进行考察,明确合欢花总黄酮部位具有抗焦虑作用；采用高架十字迷宫、明暗箱实验、埋珠实验、旷场实验和自主行为学实验,对槲皮苷的抗焦虑作用进行考察,明确槲皮苷具有抗焦虑作用；采用联合给予受体拮抗剂的方法,对槲皮苷抗焦虑可能激动的受体进行探讨。采用高效液相色谱-电化学检测器,测定槲皮苷给药对小鼠脑内单胺类递质及其代谢产物含量的影响。主要研究内容及结果如下：1 合欢花抗焦虑作用研究首先采用高架十字迷宫实验(EPM)和明暗箱实验(LDB)这两个经典的焦虑症评价模型,评价合欢花的水提液和70%乙醇提取液的抗焦虑作用。小鼠高架十字迷宫实验表明：合欢花70%乙醇提取液中剂量(6g/kg)可以显著增加小鼠在开臂活动时间和进入开臂次数的百分比。小鼠明暗箱实验表明：合欢花70%乙醇提取液中剂量组(6g/kg)可以显著增加小鼠进入明箱的时间和次数。实验结果显示：合欢花70%乙醇提取液在两个动物模型上均显示出抗焦虑作用。2 合欢花总黄酮的抗焦虑作用研究2.1 合欢花总黄酮的纯化本实验采用大孔树脂对合欢花总黄酮进行纯化,分别从以下角度考察大孔树脂对合欢花总黄酮纯度的影响：树脂类型、上样液质量浓度、上样液pH值、上样液体积流量、水洗体积、乙醇质量浓度、洗脱液体积流量、洗脱溶剂倍量、纯化次数等因素。实验结果显示,最优的纯化方法：选择NKA-9型树脂,经过预处理后,加入生药量为0.5∥mL的上样液1BV,以1.0 BV/h的上样液体积流量上样。依次用4BV水和4BV10%乙醇除杂,5BV70%乙醇洗脱,洗脱流速为1BV/h,收集洗脱液,回收溶剂,即为纯化后的黄酮。2.2 合欢花总黄酮的含量测定方法研究本实验完善了高效液相色谱法和紫外分光光度法测定合欢花总黄酮的含量,并比较两种方法的优劣。实验结果显示,两种含量测定方法测定的合欢花总黄酮含量差异小,均适用于合欢花总黄酮的含量测定。2.3 合欢花总黄酮的抗焦虑作用研究本实验采用高架十字迷宫实验(EPM)和明暗箱实验(LDB)评价合欢花总黄酮的抗焦虑作用。小鼠高架十字迷宫实验表明：与空白组相比,合欢花总黄酮低剂量组(2.5g/kg)可以显著提高小鼠在开臂活动时间和进入开臂次数的百分比。小鼠明暗箱实验表明：合欢花总黄酮低剂量组(2.5g/kg)的小鼠在明箱活动的时间和进入明箱的次数显著增加。实验结果显示：合欢花总黄酮在两个动物模型上均显示出抗焦虑作用。3 槲皮苷抗焦虑作用研究3.1 小鼠药效学研究采用高架十字迷宫实验(EPM)、明暗箱实验(LDB)、埋珠实验(MB)、旷场实验(OFT)和自主活动实验这五个行为学实验,全面评价槲皮苷的抗焦虑作用,以及对自主活动能力的影响。小鼠高架十字迷宫实验显示：槲皮苷中剂量组(5mg/kg)的小鼠在开臂活动时间和进入开臂的次数的百分比显著增加。小鼠明暗箱实验显示：槲皮苷中剂量组(5mg/kg)的小鼠在明箱活动的时间和进入明箱的次数显著增加。埋珠实验显示：槲皮苷中剂量组(5mg/kg)和地西泮组均能抑制小鼠的埋珠行为。旷场实验和自主行为学实验结果显示,槲皮苷不影响小鼠的自主活动能力。实验结果显示：槲皮苷具有抗焦虑作用,且发挥抗焦虑作用的同时不会影响小鼠的自主活动能力。3.2 机制探讨3.2.1 槲皮苷抗焦虑作用对5-HT1A受体的影响槲皮苷通过联合给予氟马西尼(GABAA受体拮抗剂)或者WAY 100635 (5-HT1A受体拮抗剂),探讨槲皮苷产生抗焦虑作用可能结合的位点。实验结果显示：WAY 100635可以显著拮抗槲皮苷的抗焦虑作用,氟马西尼未能拮抗槲皮苷的抗焦虑作用。即槲皮苷可能通过激动5-HT1A受体,产生抗焦虑作用。3.2.2槲皮苷抗焦虑作用对单胺类递质的影响运用高效液相色谱-电化学检测器法(HPLC-ECD)测定槲皮苷给药对小鼠脑内单胺类递质及其代谢产物含量的影响,包括多巴胺(DA)及其代谢产物二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA),5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)。从神经生物学角度探究槲皮苷抗焦虑作用可能的机制。实验结果显示：槲皮苷可以显著降低小鼠脑内儿茶酚胺类递质和五羟色胺类递质及其代谢产物的含量。4结论分别采用高架十字迷宫实验、明暗箱实验、埋珠实验、旷场实验和自主活动实验评价合欢花、合欢花总黄酮和槲皮苷的抗焦虑作用,明确合欢花70%乙醇提取物、合欢花总黄酮和槲皮苷均具有抗焦虑作用。本实验分别通过对合欢花总黄酮含量测定方法的探讨和纯化方法的建立,以明确合欢花总黄酮部位的纯度,同时通过液相分析发现合欢花总黄酮中的主要成分为槲皮苷。推测槲皮苷是合欢花总黄酮中抗焦虑的有效成分,并通过药理实验证实。另对槲皮苷抗焦虑作用机制研究表明：槲皮苷可能通过激动5-HT1A受体起到抗焦虑作用,并且可能抑制单胺类神经递质的合成和释放。通过本课题研究,为拓展合欢花的临床应用、丰富中医对合欢花“解郁安神”的认识、合理开发利用富含槲皮苷的植物资源提供了理论和实验依据。