研究背景: 支气管哮喘是多种细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾患。这种慢性炎症导致气道高反应性，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和(或)清晨发作加剧，多数患者可自行缓解或经治疗缓解。国内外流行病学调查表明：哮喘的患病率和死亡率在世界范围内均呈上升趋势。目前全球约有3亿哮喘患者，全球每年约18万人死于哮喘，我国至少也有1500万～2000万哮喘患者，哮喘已成为一个严重的世界性社会公共卫生问题。目前哮喘治疗以糖皮质激素治疗效果最佳，但是长期应用激素可导致严重的副作用，有些严重病例用激素不能很好控制，少数患者激素治疗无效(激素抵抗型哮喘)，因此有必要寻求新的哮喘防治方法。研究表明，哮喘的本质是变态反应性气道慢性炎症。然而，在哮喘的免疫发病机制中，经典的Th1/Th2失衡理论很难解释哮喘免疫调节失常的全过程，还存在其他免疫学机制参与调节哮喘气道炎症的形成。最新研究发现调节性T(Treg)细胞是CD4<+>T淋巴细胞的一个亚群，能积极的控制或抑制其他细胞的功能，抑制免疫反应，从而对机体免疫系统产生重要的调节作用。支气管哮喘是气道慢性炎症性疾患，同时也是外周免疫耐受机制发生缺陷的疾病，越来越多的证据表明，Treg与哮喘变态反应性炎症和在外周维持机体自身免疫耐受有着密切的关系。CD4<+>CD25<+>Treg由Sakaguchi等首先描述，是天然存在的Treg，又称胸腺源性Treg，是调节性T细胞的主要组成成分，在哮喘的免疫学发病中起着重要的作用。哮喘患儿CD4<+>CD25<+>Treg比例较正常对照组明显减低，哮喘小鼠脾脏CD4<+>CD25<+>Treg细胞占CD4<+>T淋巴细胞比例明显下降。CD4<+>CD25<+>Treg在体外可显著抑制抗原刺激的CD4<+>T淋巴细胞增殖及IL-5的分泌，而来自患过敏性疾病的病人的CD4<+>CD25<+>Treg的抑制作用显著减弱。免疫去除CD4<+>CD25<+>Treg可以显著增加C3H 小鼠屋尘螨诱导的气道高反应性、气道嗜酸性粒细胞浸润、血IgE水平及Th2细胞因子分泌。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是骨髓中造血干细胞外的另一类具有高度可塑性的细胞群体，在特定的诱导条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪细胞等间质细胞分化的能力，具有广泛的临床应用前景。近年的研究表明，MSC除具有多向分化潜能外，还具有免疫调节作用。骨髓MSC可上调CD4<+>CD25<+>Treg比例，抑制混合淋巴细胞反应(MLR)中或丝裂原PHA刺激引起的T淋巴细胞的增殖。MSC还可抑制树突状细胞的分化成熟，干扰树突状细胞的内吞功能，减少树突状细胞IL-12的分泌，使其刺激同种异体的T淋巴细胞增殖能力减低。动物体内注射MSC可减轻博来霉素诱导小鼠肺间质炎症细胞浸润和纤维化，延迟对移植皮肤发生排斥反应的时间，改善自身免疫性脑脊髓炎小鼠临床表现和组织病理学改变，抑制移植物抗宿主病。 MSC不表达主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ类分子、Fas配体和T细胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L，MSC不易被宿主免疫细胞识别，并能逃避免疫系统的免疫排斥。异基因MSC不但可以进入受体的免疫器官，而且可在体内较长期存在。因此，MSC治疗哮喘具有广泛的临床应用前景。我们设计此实验，将体外扩增的MSC植入哮喘小鼠体内，观察MSC对哮喘小鼠外周血CD4<+>CD25<+>Treg及气道炎症的影响。 研究目的: 1．体外分离培养小鼠骨髓MSC。 2．探讨小鼠骨髓MSC对哮喘小鼠外周血CD4<+>CD25<+>Treg及气道炎症的影响。 实验方法: 1．分离、培养、扩增小鼠骨髓MSC 健康3-4周龄BALB/C小鼠，无菌条件取出股骨和胫骨，培养基冲出骨髓，1000 rpm/min离心5分钟，细胞以完全培养基(DMEM/F12培养基+10﹪胎牛血清+2mmol/L左旋谷氨酰胺+100ü/ml青霉素+100μg/ml链霉素)重悬，接种至25cm<2>培养瓶，72小时后首次全量换液去除未贴壁细胞，以后每3天全量换液，细胞达到90﹪融合时传代。 2．小鼠骨髓MSC的鉴定胰酶消化第4代细胞，PBS洗2遍，PBS调整细胞浓度致10<6>/ml，流式细胞术检测细胞表面分子： CD29，CD44，CD45。第4代MSC接近融合时进行成骨和脂肪细胞诱导分化。 3．哮喘小鼠模型的制备健康6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠30只，随机分为3组，每组10只，分别为正常对照组、哮喘模型组、MSC处理组，鸡卵蛋白(OVA)抗原溶液腹腔注射致敏，OVA溶液雾化吸入激发。对照组用生理盐水替代OVA。 4．MSC处理组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入MSC，哮喘模型组以PBS经尾静脉注入。 5．观察MSC对小鼠支气管肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液细胞计数及分类、外周血CD4,+>CD25<+>Treg的影响。 6．统计学处理数据均用均数±标准差表示，组间均数比较采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。 实验结果: 1．小鼠骨髓MSC分离、培养及鉴定骨髓细胞接种于塑料培养瓶后，细胞在培养瓶散在分布，呈圆形。24小时后就见有细胞贴壁。首次换液后细胞生长迅速，呈梭形、三角形、星形，集落样生长。流式细胞术测定细胞表面标志：CD29(+)、CD44(+)、CD45(-)。MSC可向成骨和脂肪细胞诱导分化。证实小鼠骨髓MSC分离成功。 2．动物成模的判定哮喘模型组的小鼠表现、白细胞分类计数结果及支气管病理检查结果均符合哮喘小鼠模型的判定标准，证实本实验造模成功。 3．肺组织病理学变化肺组织主要病理改变：正常对照组小鼠无明显炎症改变；哮喘模型组小鼠支气管、血管粘膜下和周围肺组织有明显的炎症细胞浸润，气道上皮增生，气道黏液增多，气道上皮部分断裂脱落；MSC处理组小鼠气道炎症明显减轻。 4．BALF细胞计数和分类结果哮喘模型组小鼠BALF白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞计数显著高于对照组(P<0.05)，MSC处理组小鼠白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞计数较哮喘组显著减少(P<0.05)。 5．外周血CD4<+>CD25<+>Treg计数结果哮喘模型组小鼠外周血CD4<+>CD25<+>Treg占淋巴细胞比例显著低于对照组(P<0.05)，MSC处理组小鼠外周血CD4<+>CD25<+>Treg占淋巴细胞比例较哮喘模型组显著增高(P<0.05)。 结论: 静脉输注小鼠骨髓MSC能上调哮喘小鼠外周血CD4<+>CD25<+>Treg比例，同时对哮喘小鼠气道炎症有一定的抑制作用。