论文部分内容阅读
目的：初步比较五组趋化轴在骨髓间充质干细胞向大鼠缺血区心肌的趋化作用。方法：1.取6-8周龄SD大鼠的胫骨及股骨分离骨髓间充质干细胞（BMSCs），用全骨髓差异贴壁法培养及纯化BMSCs，并取第3代BMSCs用于本实验。用正常成年大鼠心肌制备心肌条件培养基模拟心肌微环境。BMSCs在低氧(3%O2)无血清心肌条件培养基中分别培养6小时、12小时、18小时、24小时及48小时组；通过real timePCR分别检测常氧有血清对照组及以上各时间点BMSCs中CXCR4、CCR1、CCR2、CX3CR1及c-met的表达量。2.通过开胸结扎SD大鼠左前降支（体重约250g）建立心梗模型，通过其下腔静脉注射3%的伊文氏蓝染色剂将心梗心肌分为缺血区心肌及非缺血区心肌，分别取未结扎大鼠正常心肌及心梗后1天，2天，3天，7天及14天心梗大鼠缺血区及非缺血区心肌各3只，通过real time PCR法或RT-PCR法分别检测缺血区心肌及非缺血区心肌SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CLL7表达情况。3.Transwell小室趋化实验：根据前期实验可知CXCR4、CCR2、CX3CR1表达持续升高，故在上层放置未经或经CXCR4拮抗剂AMD3100处理过的含BMSCs（约2×105/ml）无血清心肌条件培养基，下层为正常心肌或SDF-1、Fractalkine、MCP-1达峰时即心梗后1天、3天及7天的缺血区心肌制备的含血清的心肌条件培养基，在低氧条件下培养48小时，比较BMSCs迁移数量及AMD3100对BMSCs向心肌条件培养基趋化作用的影响。结果：1.BMSCs在缺血缺氧心肌条件培养基中CXCR4、CCR2、CX3CR1、c-met及CCR1表达变化以常氧有血清培养的BMSCs为对照组，BMSCs在缺血缺氧心肌条件培养基中分别培养6小时、12小时、24小时，36小时及48小时，其中CXCR4、CCR2及CX3CR1表达量显著增高，而CCR1及c-met表达量显著降低。不同时间点CXCR4的mRNA表达量分别为正常对照的4.181±0.590倍、5.484±1.228倍、12.35±1.622倍、4.646±1.491倍及1.242±0.294倍； CCR2的mRNA表达量分别为正常对照的3.095±0.177倍、5.003±0.576倍、4.245±0.885倍、8.575±6.065倍及3.288±1.506倍；CX3CR1的mRNA表达量分别为正常对照的6.455±0.957倍、11.99±1.918倍、6.762±1.241倍、7.411±3.378倍及0.162±0.022倍；CCR1的mRNA表达量分别为正常对照的0.202±0.248倍、0.125±0.101倍、0.042±0.022倍、0.050±0.026倍及0.078±0.059倍;c-met的mRNA表达量分别为正常对照的0.409±0.143倍、0.272±0.178倍、0.077±0.054倍、0.086±0.042倍及0.229±0.087倍。2.心梗后心肌非缺血区及缺血区SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表达变化分别检测正常大鼠心肌和大鼠心梗后1天、2天、3天、7天、14天非缺血区和缺血区SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表达量。非缺血区心肌各组间均目的基因表达均无显著性差异。心梗大鼠缺血区各时间点SDF-1mRNA表达量分别是正常心肌的26.74±4.957倍、17.41±2.357倍、8.138±1.083倍、2.493±0.898倍、1.918±0.977倍；MCP-1mRNA表达量分别是正常心肌的0.623±0.014倍、2.722±0.379倍、2.816±0.722倍、4.879±0.862倍、1.593±0.528倍；HGF mRNA表达量分别是正常心肌的4.038±1.696倍、12.40±3.920倍、34.440±6.804倍、2.312±0.694倍、1.736±1.618倍；Fractalkine mRNA表达量分别是正常心肌的0.523±0.294倍、3.497±1.926倍、35.94±11.02倍、4.893±0.203倍、2.588±0.845倍；CCL7mRNA表达量分别是正常心肌的43.67±11.71倍、29.99±2.902倍、12.42±2.011倍、2.072±0.105倍、2.060±0.705倍。以上各组间表现出明显的时序性变化。3.体外迁移实验：根据前期实验，BMSCs在缺血缺氧心肌条件培养基中持续高表达的CXCR4、CCR2、CX3CR1，所以我们选取了心梗后1天、3天及7天心肌缺血区组织，对与CXCR4、CCR2、CX3CR1相关3组趋化轴的趋化效果进行对比。正常心肌条件培养基组BMSCs迁移数为12.05±2.73个/HPF(高倍镜)，与正常心肌条件培养基组相比心梗1天缺血区心肌条件培养基组BMSCs迁移数为70.80±7.918个/HPF（P<0.05），心梗3天缺血区心肌条件培养基组BMSCs迁移数为39.20±5.933个/HPF（P<0.05），心梗7天缺血区心肌条件培养基组BMSCs迁移数为42.60±7.021个/HPF（P<0.05），加入AMD3100组的心梗1天缺血区心肌条件培养基组对BMSCs迁移数减少为32.20±6.140个/HPF，心梗3天缺血区心肌条件培养基组对BMSCs迁移数减少为26.6±4.278个/HPF，心梗7天缺血区心肌条件培养基组对BMSCs迁移数减少为34.2±7.369个/HPF。结论：1、缺血缺氧心肌条件培养基中培养BMSCs，其CXCR4、CCR2、CX3CR1表达量随培养时间增加较对照组持续高表达，而c-met及CCR1表达量较对照组明显降低。2、心梗后大鼠非缺血区心肌SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表达较正常组心肌无显著性差异，而缺血区心肌SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表达较正常组心肌呈现时序性变化。3、BMSCs向心梗后缺血区心肌趋化过程中SDF-1/CXCR4较其他4组趋化轴趋化能力可能更强。