目的:MicroRNA(miRNA)是由20–25个核苷酸组成的单链小分子RNA,通过与其靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)结合来调节转录后基因的表达。此外,miRNA可以作为癌基因或抑癌基因,通过特定的靶标或信号通路参与生物学过程,例如胚胎发育、细胞分化、凋亡、耐药、血管生成和肿瘤转移。课题组前期通过miRNA高通量测序和Real Time PCR检测发现,与正常宫颈组织相比宫颈癌组织中miR-195-5p的表达明显下调,并且miR-195-5p通过靶向cyclin D1a抑制细胞增殖,诱导细胞周期阻滞。因此,miR-195-5p是研究宫颈癌恶性生物学行为的一个重要“切入点”。本研究旨在研究miR-195-5p对宫颈癌细胞HeLa和SiHa恶性生物学进展的影响,并确定miR-195-5p的下游靶基因,从而进一步阐明miR-195-5p在宫颈癌侵袭、转移过程中可能发生的分子调控机制。研究方法:在宫颈癌细胞HeLa和SiHa中,转染miR-195-5p mimics和inhibitor后,通过Real Time PCR检测其过表达或抑制的转染效率。利用MTT检测其对癌细胞增殖的影响,划痕实验观察其对癌细胞迁移能力的影响,Transwell检测其对癌细胞侵袭能力的影响,TUNEL凋亡实验检测癌细胞凋亡的变化,并通过Western blot实验检测EMT相关蛋白E-cadhern、Snail、Vimentin、MMP-2、MMP-9及血管内皮生长因子VEGFA的蛋白表达情况,同时检测细胞凋亡蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2以及自噬相关蛋白LC3-II和P62的蛋白表达水平。通过生物信息学分析预测YAP1和ATG9A为miR-195-5p的靶基因,双荧光素酶实验证明miR-195-5p分别与YAP1和ATG9A结合。随后,通过构建YAP1和ATG9A的过表达质粒,与miR-195-5p mimics以及mimics阴性对照进行共转染,进而验证其是否能够逆转miR-195-5p对宫颈癌细胞的抑制作用。结果:在宫颈癌细胞HeLa和SiHa中,过表达miR-195-5p后,细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化能力明显降低,然而诱导细胞凋亡和自噬能力增加。相反,下调miR-195-5p的表达后,细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化能力明显增加,然而抑制细胞凋亡和自噬水平。双荧光素酶报告载体实验证明miR-195-5p能够分别与YAP1和ATG9A的3’UTR的特定位点结合,并对其进行负向调节进而抑制其转录或翻译。过表达miR-195-5p后YAP1的mRNA无明显变化,但是蛋白水平明显降低;此外miR-195-5p过表达后ATG9A的mRNA和蛋白水平都有明显降低。构建YAP1过表达质粒转染HeLa和SiHa后,细胞增殖活力、迁移和侵袭能力明显得到恢复;同时构建ATG9A过表达质粒转染HeLa和SiHa后,显著逆转miR-195-5p对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,以及部分恢复miR-195-5p对宫颈癌细胞凋亡和自噬的促进作用。结论:miR-195-5p通过靶向YAP1和ATG9A抑制细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化,诱导细胞凋亡和自噬。YAP1和ATG9A的过表达能够部分恢复miR-195-5p对宫颈癌细胞的抑制作用。因此阐明miR-195-5p在宫颈癌细胞恶性进展中发挥抑癌基因的作用,同时也为宫颈癌的靶向治疗提供新的思路和见解。