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目的:2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）是由多种因素引起的代谢紊乱疾病,以血糖升高及多器官系统损害为主要表现,主要病理生理改变为胰岛β细胞功能下降及机体的胰岛素抵抗。随着人口老龄化的发展趋势,T2DM的发病率及病死率逐年上升,有研究表明,在绝经后的女性,患病率较绝经前显著增加。女性雌激素减少与2型糖尿病、腹型肥胖、胰岛素抵抗及相关疾病的发生发展密切相关,给予雌激素替代治疗后以上情况明显改善。雌激素是一种类固醇激素,人类及其他高等动物体内最重要的激素之一,具有广泛的生理功能。在生殖系统、心血管系统、神经系统以及免疫系统发挥着重要的作用。卵巢分泌是雌激素的主要来源,另有少量雌激素来自于肾上腺皮质分泌以及从周围组织中转化。最近有研究表明,卵巢血管的完整性是雌激素合成的关键因素之一,当血脂异常,糖尿病等动脉硬化的危险因素存在时,卵巢血管受损,雌激素的产生会过早终止。人体内的雌激素主要有占主导地位的17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）和含量较低的雌三醇。新近发现的雌激素膜受体为一种G蛋白偶联受体（G protein-coupled estrogen receptor,GPER）,最早称为GPR30,GPER广泛分布于人体正常组织中,包括胰腺、心脏、脑、肝脏、前列腺、卵巢、血管内皮、淋巴和乳腺等。有研究表明,雌激素和雌激素类似物能作用于胰岛β细胞的雌激素膜受体,产生一种快速的促胰岛素分泌功能,可以通过增强糖皮质激素和生长激素等的活性,来间接促进对胰岛β细胞的刺激作用。葡萄糖转运体2（Glucose transporter 2,GLUT2）存在于胰岛β细胞膜上,是一类介导葡萄糖摄取的膜蛋白,是肝细胞,胰岛β细胞（啮齿类）及小肠和肾脏具有吸收功能的上皮细胞最主要的葡萄糖转运体,胰岛β细胞表达的GLUT2是其感受葡萄糖刺激一应答反应功能的前提。生理条件下,葡萄糖可经GLUT2转运进入细胞内,该蛋白与葡萄糖激酶（Glucokinase,GK）共同形成葡萄糖感受器,调节胰岛素的合成与分泌。国内外大量的研究发现,GLUT2不仅在葡萄糖代谢中具有重要作用,而且与糖尿病关系密切。GK于己糖激酶,主要存在于肝脏和胰腺组织中。当血糖升高时,胰岛细胞中GLUT2转运葡萄糖增加,葡萄糖摄取率增高,GK活性增强,从而促进葡萄糖在胰岛细胞中的糖酵解,促进胰岛素分泌。雌激素与GPER结合,会影响下游的效应分子,目前发现GPER参与信号转导的调节机制主要包括EGFR-MAPK通路、cAMP-PKA通路、PI3K-Akt通路等。有研究表明,PI3K-Akt信号通路的抑制是肥胖诱导的胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的关键所在。细胞内经典的信号通路之一是PI3K-Akt-mTOR信号途径。mTOR信号通路活性的发挥对机体能量稳态维持起重要作用。当这种稳态被破坏时,能够导致肥胖、糖尿病乃至肿瘤的发生。因此,我们在本课题中选用SD雄性大鼠及大鼠胰岛素瘤细胞（Insulin-secretingβ-cell line,INS-1）来探讨雌激素能否上调GPER,通过Akt/mTOR途径,调节胰岛β细胞的葡萄糖代谢及胰岛素分泌。研究方法:第一部分:GPER在大鼠胰腺组织及INS-1细胞中的表达对SD雄性大鼠按随机原则分为正常组（NC组）、2型糖尿病组（TM组）、2型糖尿病给药组（TD组）,TD组E2给药处理8周,后留取胰腺组织,应用免疫荧光,检测GPER蛋白的表达。分别应用正常糖培养基及高糖培养基体外培养INS-1细胞,将INS-1细胞在两种培养环境下分为对照组（不用E2干预）,不同浓度E2组(10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M),不同浓度E2组用E2处理24h,Western blot检测不同浓度E2干预后GPER蛋白表达的变化情况,确定最适E2浓度应用正常糖培养基及高糖培养基体外培养INS-1细胞。分别应用正常糖培养基及高糖培养基体外培养INS-1细胞,将INS-1细胞在两种培养环境下分为对照组、10-7M组、10-7M+G15组、G15（GPER拮抗剂）组,处理细胞24h后应用Western blot检测GPER蛋白表达情况。第二部分:E2活化GPER对胰岛β细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌的影响SD雄性大鼠分为NC组、TM组、TD组,TD组E2处理8周后,留取大鼠胰腺组织,应用免疫荧光、Western blot、Real-time PCR检测GPER、GLUT2蛋白表达;GLUT2、GK mRNA表达。血糖仪检测口服葡萄糖耐量（oral glucose tolerance test,OGTT）结果,酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测胰岛素分泌水平。体外应用正常糖培养基及高糖培养基培养INS-1细胞,分为NG组、HG组。48h后Western blot、Real-time PCR检测GPER、GLUT2蛋白表达;GLUT2、GK mRNA表达。葡萄糖摄取率试剂盒检测葡萄糖摄取率,ELISA试剂盒检测GK及胰岛素水平。第三部分:Akt/mTOR信号通路在E2调节INS-1细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌中的作用体外应用正常糖培养基及高糖培养基培养INS-1细胞,分别应用E2、G15、Akt抑制剂处理细胞24h、mTOR抑制剂（mTOR inhibitor,rapamycin）处理细胞48h。将正常糖培养基培养的INS-1细胞分组:NG组、NE组、NGI组、NAI组、NMI组,将高糖培养基培养的INS-1细胞分组:HG组、HE组、HGI组、HAI组、HMI组。Western blot检测GPER、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、GLUT2蛋白表达;Real-time PCR检测GLUT2、GK mRNA的表达。葡萄糖摄取率试剂盒检测葡萄糖摄取率,ELISA试剂盒检测GK及胰岛素水平。实验结果:第一部分:GPER在大鼠胰腺组织及大鼠胰岛细胞INS-1细胞中表达的研究1、大鼠胰腺组织及INS-1细胞及中有GPER的表达。2、E2上调大鼠胰腺组织中GPER的活性。3、INS-1细胞在两种培养基中,E2呈剂量依赖性调节GPER的表达。且10-7M E2组具有上调GPER的统计学意义。G15能够抑制GPER的表达。第二部分:E2活化GPER对胰岛β细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌的影响1、TM组GPER、GLUT2蛋白表达及GLUT2、GK mRNA表达与对照组相比均下降,血糖值较对照组升高,胰岛素水平降低。2、TD组给予E2干预后,GPER、GLUT2蛋白表达及GLUT2、GK mRNA表达均比TM组上升,胰岛素水平升高,血糖值没有明显变化。3、INS-1细胞在高糖环境中GPER、GLUT2蛋白表达及GLUT2、GK mRNA表达均下降,葡萄糖摄取率,GK活性及胰岛素水平均降低。第三部分:Akt/mTOR信号通路在E2调节INS-1细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌中的作用在两种培养环境下:1、10-7M E2增加INS-1细胞中GPER、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、GLUT2蛋白表达。2、G15降低INS-1细胞中GPER、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、GLUT2蛋白表达。3、Akt抑制剂降低p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、GLUT2蛋白表达。4、rapamycin降低p-mTOR/mTOR、GLUT2蛋白表达。5、10-7M E2增加INS-1细胞中GLUT2、GK mRNA的表达,增加葡萄糖摄取率,GK活性及胰岛素分泌水平;G15、Akt抑制剂、rapamycin降低GLUT2、GK mRNA的表达,降低葡萄糖摄取率,GK活性及胰岛素分泌水平。结论:1、SD雄性大鼠胰腺组织及INS-1细胞中存在GPER,E2可以活化GPER。2、E2可调节大鼠胰腺组织及INS-1细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌。3、Akt/mTOR通路参与了E2对大鼠胰腺组织及INS-1细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌的调节。4、在T2DM大鼠及高糖培养基培养的INS-1细胞中,GPER及Akt/mTOR通路相关蛋白表达下降,葡萄糖代谢及胰岛素分泌受到抑制。