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抗菌肽是一类由基因编码的阳离子小肽,具有先天免疫功能,种类繁多,对细菌、真菌、病毒、原虫及癌细胞等都具有杀伤作用,且不易产生耐药性。近年来,抗生素的广泛使用造成了多药耐药菌感染在临床上蔓延,因而,抗菌肽的低耐药性及抗菌作用在预防与治疗耐药菌感染方面具有广阔的应用前景。更重要的是,抗菌肽独特的抗菌作用机制使其有望开发成一类新型的广谱高效抗菌药物。抗菌肽 Scolopin-2(S-2)是从少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)中分离得到的阳离子多肽,由25个氨基酸组成,N端富含亲水性氨基酸残基,C端富含疏水性氨基酸残基。抗菌肽Scolopin-2(S-2)经酰胺化修饰获得Scolopin-2-NH2(S-2-N),研究发现,它具有比其母体肽S-2更强的抗菌活性,但对抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌作用机制尚未知晓。因此,本论文对抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌活性、理化性质进行了研究,并对二者的抗菌机制在细胞水平和分子水平上进行了探讨,这将为抗菌肽发展为新型抗菌药物提供一定的理论依据。本课题研究具体分为以下三个部分:1.探究抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌活性和理化性质。首先,采用琼脂糖孔穴法比较了抗菌肽S-2-N和S-2对大肠杆菌(K12D31)、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草杆菌的抗菌活性,结果发现二者均有明显的抗菌效果,且S-2-N的抗菌活性强于母体肽,同时,筛选大肠杆菌(K12D31)作为抗菌敏感菌株来进行后续抗菌机制的研究;另外,还研究了二者的理化性质,即对环境的敏感性,通过琼脂糖孔穴实验发现,抗菌肽S-2-N和S-2具有一定的耐热性、耐酸碱性及抵抗离子和消化酶的能力。2.在细胞水平上对抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌作用机制的研究。首先,利用激光共聚焦显微镜观察了 FITC-S-2-N和HTC-S-2在大肠杆菌(K12D31)细胞内的位置,结果显示,二者均能快速进入细胞质内;其次,通过电子显微镜探究了大肠杆菌经抗菌肽处理后细胞结构的变化,发现S-2-N能够在2 h内迅速瓦解细菌细胞,导致内容物泄露;最后,通过流式细胞仪检测了经S-2-N和S-2处理后大肠杆菌的细胞膜完整性及穿透细胞膜的效率,结果发现在短时间内(30 min)二者均能引起一定程度的细胞膜损伤,但抗菌肽S-2-N穿透细胞膜的效率更高。3.在分子水平上探究了抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌作用机制。首先,通过酶标仪检测了大肠杆菌(K12D31)细胞内DNA和RNA含量的变化,发现经抗菌肽S-2-N和S-2处理后,核酸合成量均有所下降;其次,通过凝胶阻滞电泳技术分析发现,不同浓度梯度的S-2-N和S-2可以不同程度地结合DNA和RNA,从而影响大肠杆菌(K12D31)细胞代谢;采用圆二色谱法研究了 DNA结构的变化,结果显示,DNA的正峰和负峰都有降低现象,说明抗菌肽S-2-N和S-2影响了 DNA的二级结构;最后,通过流式细胞术和qRT-PCR技术分析了抗菌肽S-2-N和S-2对大肠杆菌(K12D31)细胞周期及细胞内与DNA复制和修复相关基因的影响,从R期细胞增多表明了抗菌肽S-2-N和S-2阻滞了大肠杆菌(K12D31)细胞周期的进行,并证明了抗菌肽S-2-N和S-2影响了大肠杆菌(K12D31)细胞内与DNA复制和修复相关基因的表达。综上所述,抗菌肽S-2和S-2-N通过破坏大肠杆菌(K12D31)细胞膜,结合DNA和RNA,影响DNA二级结构,控制细胞周期进行及影响细胞内与DNA复制和修复相关基因的表达来达到抑菌效果。该研究结果为抗菌肽应用于临床治疗多药耐药菌感染等方面提供了必要的实验和理论依据。