论文部分内容阅读
目的：原发性肝癌是全球范围内第五大最为常见的恶性肿瘤,并高居全球恶性肿瘤死因第二位。目前全球原发性肝癌病人中最为常见的病理类型是肝细胞癌,所占比例大约为70%到85%。尽管肝细胞癌已被深入研究多年,其病因及分子生物学机制尚未完全阐明。与此同时,目前针对肝细胞癌的治疗手段仍十分有限,肝癌患者的预后仍不容乐观。因此,研究探索与HCC发生发展密切相关的分子生物学机制对于提高HCC诊断及治疗水平具有十分重大的意义。ADRM1(adhesion-regulating molecule1)是真核细胞26S蛋白酶体重要的泛素受体之一,并且能与蛋白酶体19S调节亚基通过帽状结构相连结从而将去泛素化酶UCH37募集至26S蛋白酶体。近年来越来越多的研究表明ADRM1在多种恶性肿瘤中呈高表达状态,并且可能扮演了类似癌基因的角色。尽管如此,ADRM1肝细胞癌发生发展过程中的作用尚不明了。在本课题中,我们研究了ADRM1在肝细胞癌中的表达情况、ADRM1在肝癌细胞恶性生物学行为中的功能作用及其可能的下游分子机制,以期为肝细胞癌的诊断、治疗提供新的潜在分子靶点。方法：采用实时定量RT-PCR和免疫组织化学方法检测肝细胞癌组织和癌旁肝组织ADRM1mRNA和蛋白表达情况,采用RT-PCR和Western blot检测三种不同转移潜能肝癌细胞(Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H) ADRM1mRNA和蛋白表达水平；利用短发夹干扰RNA技术沉默MHCC97-H细胞ADRM1表达水平,并采用MTT、流式细胞术、Transwell小室实验分别检测基因沉默ADRM1表达对MHCC97-H细胞增殖、凋亡、细胞周期、体外侵袭转移能力的影响；采用Western blot检测上述三种肝癌细胞核内NF-κB p65和IκB-a表达水平,以期揭示ADRM1表达与肝癌细胞NF-κB水平的潜在联系。利用RT-PCR和Western blot分别检测基因沉默ADRM1表达后MHCC97-H细胞IκB-α的mRNA和蛋白表达及核内NF-κB p65蛋白表达的变化,并采用凝胶迁移率实验(EMSA)检测ADRM1基因沉默对MHCC97-H细胞NF-κB活性水平的影响。结果：ADRM1mRNA和蛋白在肝细胞癌组织中的表达水平显著高于其在癌旁肝组织中的表达水平。此外,ADRM1在肝癌组织中的蛋白表达水平与肝癌静脉侵犯密切相关。ADRM1在Hep3B. MHCC97-L和MHCC97-H细胞中的mRNA和蛋白表达水平逐次升高,与肝癌细胞的转移能力相关；我们成功构建特异性针对ADRM1的短发夹干扰RNA表达载体并将其转染至MHCC97-H细胞。后续的功能实验表明基因沉默ADRM1表达能在体外抑制MHCC97-H细胞增殖、侵袭、转移能力,并导致细胞周期G0/G1期阻滞和自发凋亡增多；在上述三种肝癌细胞中(Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H),核内NF-κB p65表达水平逐渐升高,与ADRM1表达趋势一致,而IκB-α表达水平逐渐降低。基因沉默ADRM1后,MHCC97-H细胞核内NF-κB p65蛋白表达下调,IκB-α蛋白表达水平上升,但IκB-α mRNA表达无明显变化。最为重要的是,基因沉默ADRM1后MHCC97-H细胞NF-κB活性水平下降。结论：ADRM1在肝细胞癌组织中呈高表达状态,并且其表达水平与肝癌静脉侵犯密切相关；ADRM1在肝癌细胞中的表达水平与细胞转移能力相关；针对ADRM1的特异性基因沉默能在体外显著抑制肝癌细胞增殖、侵袭、转移能力,并且能上调自发凋亡水平,引发细胞周期G0/G1期阻滞；ADRM1能通过介导IκB-α降解过程促进肝细胞癌中NF-κB的持续性激活,而这也可能是ADRM1发挥其促癌作用的重要机制之一。