甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,其发病率近二十年在全球范围内呈明显上升趋势,在女性患者发病率已由第12位上升至第7位。甲状腺癌根据其病理特点分为乳头状癌、滤泡癌、髓样癌、未分化癌等,其中甲状腺乳头状癌约占甲状腺癌的85%以上。2006年世界卫生组织内分泌器官肿瘤病理学和遗传学对甲状腺乳头状癌的定义是恶性上皮性肿瘤显示滤泡细胞分化的形态和特征性的核。乳头状癌特征性的核包括:增大的、卵圆形、长的和重叠核,核沟和核内假包涵体。典型的核为清澈的或毛玻璃样。乳头状癌的诊断依赖于细胞核的这些特征,而且这些特征细胞必须占肿瘤中相当大的部分。由于受到专业水平和主观因素的影响,在临床病理工作中对甲状腺乳头状癌细胞核特征的识别常常出现意见不一致。即使具备丰富的经验和卓越的技术,有时面对非典型特征核,也难做出明确诊断,如何鉴别典型乳头状癌核的特征成为难点。尽管分子诊断技术被应用于甲状腺乳头状癌的诊断,但由于诊断费用高、特异性有待提高,在临床工作中应用价值有限。因而,寻找临床病理工作中常用、且特异的免疫组化标记物,进而为甲状腺乳头状癌的病理诊断提供辅助依据已成为临床病理研究的热点之一。甲状腺乳头状癌总体预后良好,术后10年无病生存率超过90%,但仍有低于10%的患者出现早期出现复发、转移。尽管性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤侵犯程度、发病灶单发或多发,有无淋巴结转移以及肿瘤TNM分期等因素与甲状腺乳头状癌预后相关,但是,在临床上有时TNM分期相同的甲状腺乳头状癌预后却不尽相同,提示影响甲状腺乳头状癌预后的潜在分子机制不同,因此,寻找与甲状腺乳头状癌生物学行为相关的分子标记物,对甲状腺乳头状癌病例进行分层管理,筛选出预后不良的高危患者,对指导甲状腺乳头状癌的治疗及预后判断具有重要意义。甲状腺乳头状癌的传统治疗方法包括手术切除、术后辅助内分泌治疗及131I治疗,多数患者经传统治疗后预后良好,但仍有低于10%的患者应用传统治疗无效,导致患者出现远处转移、甚至死亡。近年来,分子靶向治疗在临床实践中取得了显著的疗效,明显改善了患者的生存。已有研究表明人类多种良恶性肿瘤中存在BRAF突变,且BRAF突变与多种肿瘤预后相关。甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变率达29%-83%,平均为45%。研究显示多靶点激酶抑制剂BAY43-9006(索拉菲尼)能抑制BRAFV600E基因突变的甲状腺乳头状癌细胞的增殖,对伴BRAFV6000E突变常规治疗困难的甲状腺乳头状癌有很好的疗效。由于BRAFV600E突变抑制剂在甲状腺乳头状癌治疗中的作用,迫切需要一种快捷、廉价、简便的技术方法检测BRAFV600E突变。但是,目前检测BRAFV600E基因突变的方法需要昂贵的设备和专业的分子检测技术,这限制了BRAFV600E基因突变检测在临床病理工作中的应用。与基因检测相比,免疫组织化学方法因其快速、简便、廉价等优点易于在病理科开展。因此,选择一种敏感度高且特异性强的BRAF基因V600E突变的抗体应用于临床病理工作中,将为甲状腺乳头状癌患者的治疗提供极具价值的参考指标。21世纪的医学将从"疾病医学"向"健康医学"发展,从"重治疗"向"重预防"发展。了解疾病的发生发展机制不仅有助于早期预防或及早治疗,提高患者的生存质量,还有助于节约医疗资源。甲状腺乳头状癌的临床特点之一是常多灶发生,多发病灶比例为18%-87%,多发病灶与淋巴结转移、远处转移及局部复发密切相关。对于甲状腺乳头状癌多发病灶的克隆起源一直存在争议。目前研究主要存在三种观点:一些学者认为多发病灶为单克隆起源,由甲状腺乳头状癌腺内转移引起;另一些学者认为多发病灶为多克隆起源,它们各自独立发生;还有研究得出的结论是多发病灶部分由腺内转移引起,部分为各自独立发生,即单克隆与多克隆并存。研究甲状腺乳头状癌多发病灶的克隆起源不仅有助于阐明甲状腺乳头状癌发病机制、判定预后,还有助于为患者选择合理的治疗方式。目的:1.寻找与甲状腺乳头状癌病理诊断和预后相关的标记物,为甲状腺乳头状癌病理诊断和预后判断提供参考依据。2.研究甲状腺乳头状癌BRAF基因V600E突变与蛋白表达的相关性,探讨检测BRAF基因V600E突变蛋白预测BRAF基因V600E突变的可能性。3.研究甲状腺乳头状癌多发病灶的克隆起源,为阐明甲状腺乳头状癌发病机制和选择合理的治疗方式提供参考依据。方法:1.应用免疫组织化学(MaxVision法)对66例人甲状腺乳头状癌及25例结节性甲状腺肿组织中雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR),CK19、E-cadherin、细胞周期蛋白 D1(CyclinD1)和ki67进行检测,探讨它们在甲状腺良恶性病变中的表达差异。并分析ER、PR、CK19、E-cadherin、CyclinD1和ki67与甲状腺乳头状癌性别、年龄、淋巴结转移、病灶大小、TNM分期等的关系。2.应用PCR-荧光探针法及免疫组织化学方法检测40例甲状腺乳头状癌组织中BFAFV600E基因突变及蛋白表达情况,分析BRAFV600E突变及蛋白表达与甲状腺乳头状癌临床病理参数的关系。并分析甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变蛋白表达量与基因拷贝数的关系。3.应用X染色体失活方法检测89例女性甲状腺乳头状癌多发病灶克隆起源。4.统计学处理应用SPSS16.0,采用卡方检验,以P<0.05为有显著性差异。结果:1.本组66例甲状腺乳头状癌中ERa表达阳性率56.1%,而25例结节性甲状腺肿中阳性率16%,两者差异具有统计学意义(χ2=11.755,P<0.05);在甲状腺乳头状癌中,ERa阳性细胞比例为5%-75%,阳性评分3-7分,均高于结节性甲状腺肿的ERa阳性细胞比例(2%-10%)和阳性评分(4分)。2.甲状腺乳头状癌中PR阳性率(54.5%)显著高于结节性甲状腺肿的阳性率(16%),两者差异具有统计学意义(χ2=6.722,P<0.05)。甲状腺乳头状癌PR表达强度(阳性评分3-8分)高于结节性甲状腺肿(阳性评分4-6分)。3.CK19在甲状腺乳头状癌中的表达率为98.5%,明显高于结节性甲状腺肿的阳性表达率(64%),P<0.05;且CK19在甲状腺乳头状癌中阳性表达分值多为8分,即>60%的肿瘤细胞呈弥漫强阳性,而结节性甲状腺肿中阳性分值多为5分,即>10%-1/3细胞阳性表达,其中2例结节性甲状腺肿70%的癌细胞CK19呈弱至中等强度表达。4.甲状腺乳头状癌E-cadherin阳性表达率为88.3%,而结节性甲状腺肿E-cadherin表达阳性率为100%,两者比较统计学差异明显(χ2=4.740,P<0.05)。5.CyclinD1在甲状腺乳头状癌中阳性表达率为97%明显高于结节性甲状腺肿的阳性率(64%),P<0.05;两者在表达强度和阳性细胞数无明显差异,均为以50%-75%细胞中等强度表达为主。6.ER+PR、ER+CK19、ER+CyclinD1、ER+PR+CK19、ER+PR+CyclinD1,以及PR+CK19+CyclinD1同时阳性表达,在甲状腺乳头状癌中的阳性率分别为30.0%、52.5%、45.5%、30.30%、31.82%、45.45%,在结节性甲状腺肿中阳性率分别为4.0%、8.0%、4.0%、4.0%、0%、8%,两者差异均具有统计学意义。7.女性38例甲状腺乳头状癌中,病灶>1cm组ER表达阳性率为82.4%,病灶≤1cm组ER表达阳性率为33.3%,两者差异具有统计学意义(χ2=12.046,P<0.05);男性28例甲状腺乳头状癌中,病灶≤1cm组ER表达阳性率为91.7%,病灶>1cm组ER表达阳性率为25%,两者差异具有统计学意义(χ2=12.253,P<0.05)。8.女性甲状腺乳头状癌PR阳性率(57.9%)显著高于男性甲状腺乳头状癌PR阳性率(28.6%),两者差异具有统计学意义(χ2=5.591,P<0.05)。9.女性甲状腺乳头状癌E-cadherin阳性率(94.7%)显著高于男性甲状腺乳头状癌E-cadherin阳性率(67.9%),两者差异具有统计学意义(χ2=8.386,P<0.05)。10.男性甲状腺乳头状癌Ki67阳性率(10.7%)显著高于女性甲状腺乳头状癌Ki67阳性率(0%),两者差异具有统计学意义(χ2=4.265,P<0.05=。男性年龄>45岁组Ki67阳性率(30.0%)显著高于≤45岁年龄组(0%),两者比较具有统计学意义(χ2=6.048,P<0.05)。11.应用PCR-荧光探针法检测BRAFV600E突变率为85%(34/40例)。应用免疫组化方法检测BRAFV600E蛋白表达阳性率为90%(36/40例)。BRAFV600E(VE1)抗体灵敏度为100%,特异度为66.67%。12.应用PCR-荧光探针法检测40例甲状腺乳头状癌组织BRAFV600E突变率,在≤45岁组与>45岁组,男性与女性,病灶≤1cm与病灶>1cm,有和无淋巴结转移组之间进行比较,均无统计学差异。13.当以BRAFV600E突变蛋白免疫组化评分3+判定为阳性时,>45岁甲状腺乳头状癌组中BRAFV600E蛋白表达阳性率(50%)高于≤45组(36.63%),两者比较无统计学差异。有淋巴结转移组BRAFV600E蛋白表达阳性率(50%)高于无淋巴结转移组(38.36%),两者比较无统计学差异。14.BRAFV600E突变免疫组化评分1+病例PCR-荧光探针法检测BRAFV600E突变的平均ΔCt值(4.72)明显高于免疫组化评分≥2+病例的平均ΔCt值(2.85)。15.提取89例女性甲状腺乳头状癌多发病灶的癌旁正常组织,提取基因组DNA后扩增人雄激素受体基因,结果出现两条带的有11例,人雄激素受体基因的杂合率为12.4%(11/89)。11例中甲基化敏感的限制性内切酶HhaI消化后出现两条带的有6例。16.在6例14个不同癌灶中,克隆起源相同者3例,占50%(3/6),克隆起源不同者2例,占33.3%(2/6),其中病例5左侧甲状腺2个癌灶克隆起源不相同,右侧甲状腺1个癌灶与左侧甲状腺中的1个癌灶为同一克隆起源。结论:1.ERa、PR、CK19、CyclinD1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达率和表达强度显著高于结节性甲状腺肿;提示ERa>10%的细胞中等强度阳性、PR>25%细胞中等强度阳性、CK19和CyclinD1弥漫(或>80%)中等强度阳性是甲状腺乳头状癌病理诊断和鉴别诊断中有意义的辅助诊断指标。2.ER+PR+CyclinD1或+CK19蛋白同时阳性表达是甲状腺乳头状癌诊断和鉴别诊断重要的参考指标。3.E-cadherin阴性同时CK19或CyclinD1阳性是诊断甲状腺乳头状癌较为特异的辅助诊断指标。4.ER蛋白表达阳性率与甲状腺乳头状癌的病灶大小有关;在女性组中,病灶>1cm者ER阳性率高于病灶≤1cm组;在男性组中,病灶>1cm者ER阳性率低于病灶≤1cm组ER阳性率;提示在女性甲状腺乳头状癌中雌激素/ER可能起着促使细胞增殖的作用,是预后不良的因素之一,而在男性甲状腺乳头状癌中雌激素/ER所起的作用可能和女性甲状腺乳头状癌不同。5.PR蛋白表达阳性率与甲状腺乳头状癌性别有关,女性甲状腺乳头状癌PR阳性率高于男性甲状腺乳头状癌;提示PR高表达可能是女性甲状腺乳头状癌预后较男性甲状腺乳头状癌预后好的分子机制之一。6.男性、年龄>45岁、以及Ki67阳性是甲状腺乳头状癌预后不良的因素。7.PCR-荧光探针法和免疫组织化学方法均可作为甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变的检测方法。应用免疫组化BRAFV600E(VE1)抗体检测甲状腺乳头状癌组织中BRAFV600E突变具有较高的敏感性和特异性。8.应用免疫组化BRAFV600E(VE1)抗体检测甲状腺乳头状癌组织中BRAFV600E突变蛋白可预测BRAF基因V600E突变。9.本组89病例女性多发病灶甲状腺乳头状癌,癌旁正常组织中人雄激素受体基因杂合子发生率为12.4%(11/89)。10.6例(共14个癌灶)甲状腺乳头状癌中,克隆起源相同者50%(3/6),克隆起源不同者33.3%(2/6);提示女性甲状腺乳头状癌多发病灶单克隆起源和多克隆起源并存。