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大叶蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg）为葡萄科蛇葡萄属植物,其主要药用部位为叶,临床上可用于治疗高血压等。课题组前期研究表明,黄酮类化合物为其主要活性成分,包括二氢杨梅素（蛇葡萄素）、杨梅苷、杨梅素和槲皮素等。这些黄酮类次生代谢产物在不同时期的叶中含量差异显著。本研究采用双向电泳技术对大叶蛇葡萄进行了蛋白组学研究,采用Illumina测序技术对其不同季节的叶片进行了转录组测序,获得了丰富的基因功能注释信息。同时基于不同季节叶片之间基因表达量的差异性,探讨了相关功能基因在该植物黄酮类化合物生物合成中发挥的作用。具体研究如下:1.采用高效液相色谱法分别同时测定了5月、8月及10月采收的大叶蛇葡萄叶中二氢杨梅素和杨梅苷两种活性成分的含量。结果表明,二氢杨梅素:5月>8月>10月;杨梅苷:5月>10月>8月。2.采用酚抽提法提取了5月、8月及10月大叶蛇葡萄叶片中的蛋白质,并进行了双向电泳分析。用考马斯亮蓝G-250染色,蛋白质在水平和垂直两个方向均得到了较好的分离,获得了背景清晰、分辨率和重复性均较好的图谱。选用了pH4-7范围内的IPG胶条进行后续实验,3个样品分别两次平行试验。其斑点匹配率分别为82.11%、73.07%、78.29%。大叶蛇葡萄叶片蛋白质的等电点主要分布在5.06.0之间,分子量主要分布在1525 kD之间。3.把凝胶图谱上的蛋白斑点经软件匹配成对、数据分析和两两比对,以丰富表达2倍以上变化的蛋白点作为差异蛋白,通过MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析,鉴定了其中的13个蛋白。试验结果初步推测,大叶蛇葡萄叶片中主要活性成分二氢杨梅素的含量与F3H和F3H-1这两个蛋白质的表达呈正相关。4.采用Illumina测序技术得到了5月、8月、10月大叶蛇葡萄叶片的转录组测序数据,所有样本有效数据Q20均超过95%,Q30均超过90%,通过数据组装共获得了83,886条unigenes,平均长度为814 bp,最大长度为17,500 bp,N50长度达到1,648 bp,表明测序和组装质量均较好。通过与GO、KEGGko、Pfam、Eggnog、TmHMM、SignalP等数据库比对,共有59.67%的序列与已报道的其他物种基因有较高的同源性。5.共有22,788个unigenes被注释到GO数据库,分为3个主要功能类别,然后进一步分为52个亚组,包括14个细胞成分（CC）、14个分子功能（MF）和24个生物过程（BP）。在KEGG数据库中搜索大叶蛇葡萄所有的unigenes,共注释到15,149个条目。转录组数据显示,1,458份转录物编码潜在的转录因子,可分为47个转录因子家族。Pearson积矩相关系数分析表明季节相差越大的大叶蛇葡萄叶片之间相关性越小,基因表达量差异较大;季节越接近的大叶蛇葡萄叶片之间相关性越大,基因表达量差异较小。设定满足筛选条件FDR<0.05且∣log2FoldChange∣>1的共有基因为差异表达基因（DEGs）。5月和8月共有9,096个DEGs,其中5月上调3,905个,8月下调5,191个;5月和10月共有10,613个DEGs,其中5月上调3,747个,10月下调6,866个;8月和10月共393个DEGs,其中8月上调64个,10月下调329个。共有14,446个DEGs映射到GO数据库,其中4,063个DEGs在KEGG数据库得到注释。其差异主要体现在黄酮的生物合成（ko00941）及黄酮和黄酮醇的生物合成（ko00944）两条代谢通路上。黄酮生物合成路径（ko00941）中,上调表达的酶包括3种:黄烷酮-4-羟化酶（F4H）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶。黄酮和黄酮醇的生物合成（ko00944）中,上调表达的酶包括4种:黄烷酮-3’,5’-羟化酶（F3’5’H）、黄烷酮3’-羟化酶（F3’H）、类黄酮3-甲基转移酶（F3MT）、类黄酮3’,5’-甲基转移酶（F3’5’MT）。6.研究大叶蛇葡萄中黄酮类化合物的生物合成路线,观察到编码15种关键酶的31个unigenes与黄酮类化合物的生物合成有关,其中18个差异表达基因,包括CHS,PAL,F3H,F3’5’H,C4H,F3’H,ANS,F3’5’MT和F3MT,在5月份表达最高,而8个差异表达基因,包括LAR,HCT和DFR在10月份表达最高。与黄酮类积累和生物修饰相关的葡萄糖基转移酶和UDP-糖基转移酶具有相同的表达水平,大多数在8月或10月高表达,而编码甘露糖基转移酶和木糖基转移酶的基因在5月高表达。在我们的分析中,5个差异表达基因被注释到MYB,2个差异表达基因被注释到bHLH,3个差异表达基因编码为WD40重复蛋白,78个差异表达基因注释为CYP450。7.通过KEGG代谢通路和对黄酮类化合物生物合成相关的基因表达量进行分析,初步筛选出与大叶蛇葡萄中二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素和槲皮素生物合成相关的5种差异表达基因,分别为FLS、F3’5’H、F3OM、DFR、LAR。采用qRT-PCR技术对5种酶基因进行基因表达水平检测,得到了RNA和qRT-PCR之间的相关系数r2为0.9222（r=0.9603）,验证了转录组测序结果的准确性。F3’5’H和F3OM在转录组测序中的表达量均为5月>8月>10月,与二氢杨梅素含测结果一致,验证了KEGG代谢通路中F3’5’H可以催化二氢槲皮素合成二氢杨梅素。同时FLS测序表达量为8月>5月>10月,与杨梅素含测结果一致,证实了FLS能催化槲皮素合成杨梅素。8.以大叶蛇葡萄叶片为实验材料成功克隆了其一个CHS基因全长,利用qRT-PCR和RACE技术成功分离了大叶蛇葡萄AmCHS基因全长。该基因为亲水性蛋白质,分子量为42.8 KDa,包含了一个长度为1,182 bp的开放阅读框（ORF）,编码393个氨基酸残基。大叶蛇葡萄AmCHS所编码蛋白质信号肽平均值为0.143,小于0.5。BLAST搜索比对发现与同科葡萄CHS相似性高达94%,表明该序列的准确性。同源性分析,与大豆、矮牵牛、虎杖、拟南芥、银杏相似性分别为87.79%、82.26%、84.56%、84.21%、82.70%。系统发育树中与葡萄汇成一支,说明亲缘接近的物种具有相似的CHS基因遗传信息。